花粉介导法获得油菜转基因植株研究

以甘蓝型冬油菜品种晋油7号为受体，载有GUS基因的质粒pBI121为供体，在7.5％的蔗糖等渗溶液中，通过花粉介导转化方法将GUS基因导入油菜花粉，随着花粉管的萌发进入胚囊，参与有丝分裂，将外源质粒转入受体材料。经田间植株性状比较、GUS组织化学定位检测、PCR扩增检测及PCR-Southern杂交检测，证明外源GUS基因已整合到油菜基因组中。     

植物叶绿体遗传转化及研究进展

叶绿体遗传转化与传统的细胞核遗传转化相比具有许多独特的优点：外源基因表达效率高,可同时转化及表达多个基因,由于通过母性遗传,因此没有基因沉默现象及位置效应,也不会造成外源DNA的扩散。目前已经有超过四十多个外源基因整合到烟草等作物的叶绿体基因组中,表现出理想的农艺性状或作为生物反应器表达高水平的生物疫苗。本文对植物叶绿体基因组转化技术的原理和优点,外源基因导入叶绿体基因组的方法,以及目前叶绿体转化研究的最新进展进行了综述,并对其应用进行了展望。     

利用番茄果实特异启动子E8改造‘外源基因清除’的表达载体及转化金柑研究

利用"外源基因清除"技术(‘Gene-Deletor’),将外源基因从转基因金柑果实中彻底清除,可以达到用转基因作物生产出非转基因食品的目的。本研究利用引物pE8F和pE8R从樱桃番茄中克隆果实特异启动子E8,通过SalⅠ和SmaⅠ双酶切置换掉"外源基因清除"载体(pCambia-LF-polseed-FLP,简称Y-A)中的花粉、种子特异启动子PAB5,重新构造"外源基因清除"载体Y-A-E8,利用农杆菌EHA105介导转化实生态金柑,获得转化植株,并通过nptⅡ基因特异引物nptⅡ-F和nptⅡ-R PCR检测阳性转化植株。载体Y-A-E8 SalⅠ和SmaⅠ双酶切结果表明,E8启动子成功替换启动子PAB5,Y-A-E8经EHA105介导转化成功获得11株转化植株且PCR检测到6株为Y-A-E8转基因植株。研究结果可为"外源基因清除"技术在转基因金柑方面的应用提供参考。     

根癌农杆菌转化棉花花粉的研究

用根癌农杆菌感染棉花花粉获得的含有外源基因的花粉可与卵细胞自然结合,产生的转化细胞体不存在转化细胞与非转化细胞间的嵌合现象等问题,且转化方法简单,易操作。由于这种感染发生在花粉培养液中,为保证感染过程中花粉不破裂并具有生活力,以及使农杆菌有较高的感染力,必须有适宜的培养液,包括适宜的营养元素和渗透压。研究表明,在含有0.1%H3BO3、0.3?(NO3)2、0.2%MgSO4·7H2O、0.1%KNO3以及45%蔗糖的培养液中培养的花粉,能够保证有95%以上的花粉不破损且有生活力,且其萌发率平均可达58.5%。转化后的花粉经瞬时GUS检测和转化后花粉破损率表明,在附加有1‰体积比的Tween 20的含有农杆菌的花粉培养液中进行抽真空处理的方法是较有效的转化方法。所获得的种子萌发后经卡那霉素筛选、GUS稳定表达检测以及Northern杂交验证,获得4棵转基因植株。     

花粉在植物遗传研究中的应用

高等植物的花粉是一种理想的植物遗传转化材料。将花粉作为外源DNA的受体或媒介进行转基因研究,已成为现代植物遗传转化技术中的重要部分。小孢子花粉可以在植物体内自然发育为成熟花粉然后参与受精作用,或者经过小孢子培养进行孤雌生殖从而形成单倍体植抹,还可以在离体培养条件下使未成熟花粉发育成为可育花粉。笔者分别简要介绍了以上3种途径的研究现状、花粉培养方法以及在植物遗传转化中的应用,并通过对各方法优缺点的综合评价,为科研人员和育种工作者进行花发育机制研究、功能基因表达和作物遗传改良提供了一条新的思路。     

纳米磁珠介导牡丹花粉转基因技术的初步分析

磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)可以吸附DNA,作为一种新型基因载体应用于转基因育种。本研究旨在探索MNPs介导外源基因进入牡丹花粉,为利用携有外源基因的花粉进行授粉,获得转基因种子提供依据,本研究制备了MNPs与DNA的复合物;利用扫描电子显微镜与透射电子显微镜观察了牡丹花粉的形态结构;用花粉离体萌发法测定了供试牡丹花粉磁转染前后的生活力。结果表明:MNPs与DNA的质量比为1:1~1:10时,MNPs均可以与DNA稳定结合,并可以保护DNA免受酶的消化作用;牡丹花粉为长球形,萌发孔为三孔沟类型,位于萌发沟内;‘凤丹’牡丹、‘京红’牡丹及紫斑牡丹的花粉均具有较高的萌发力,且经磁转染后的三种牡丹花粉萌发力保持在50%以上,能够用于正常杂交授粉。本研究首次采用四氧化三铁纳米磁转化技术介导牡丹花粉转基因,弥补了花粉介导牡丹转基因方法研究的空白,从而有助于牡丹分子育种进程的推进。     

烟草叶绿体16S启动子的克隆改造及转基因植株的获得

设计引物并克隆了烟草叶绿体16SrDNA基因的启动子,并在其下游加入了rbcL基因的SD序列,以使该启动子能有效翻译外源基因;进一步以aadA基因作为外源基因,以psbA基因的3’序列为终止子,构建成aadA基因表达盒;将此表达盒插入烟草叶绿体同源片段trnK-psbA-trnH中,构建成烟草叶绿体转化及表达载体p16T。用基因枪微弹轰击转化     

花粉介导法将萝卜抗菌肽基因导入野罂粟的影响因素研究

以野罂粟开放花蕾为受体,载有萝卜抗菌肽AFP(antifungal protein)基因的质粒pBIAFP为供体,在不同浓度的蔗塘溶液中,加入新鲜花粉与含有目的基因的质粒DNA,应用SKH250LH型超声波震荡器进行震荡处理得到花粉处理液,在不同的时间用带有Coolsnap的OLYPUS光学显微镜下观察野罂粟花粉萌发情况;在不同授粉时间后,辅以人工授粉的方法将花粉处理液滴注野罂粟柱头上,套袋后获得种子,测定其结实率。实验证明：利用花粉介导法进行萝卜抗菌肽基因转化,以蔗糖浓度11%,处理后10-15h后的野罂粟花粉萌发最好;在蔗糖浓度8%的溶液中,以5h的结籽量较好。后代经卡那霉素筛选和PCR检测,初步证明外源AFP基因整合到野罂粟基因组中,并获得转基因T1代。为特殊中药材育种提供一个新方法。     

植物防范转基因逃逸的分子策略

转基因植物的外源基因可以通过花粉、种子、分泌物等方式释放到环境中去,会造成潜在的生态风险。因此如何防范转基因的逃逸,成为人们所关注的重点。综述了几种防范转基因逃逸的分子策略：叶绿体转化法、雄性不育法、终止子技术、染色体组特异性选择、外源基因删除法,分析了这几种方法的优势及存在的问题,并对将来如何更好地防范植物转基因逃逸提出了一些建设性的对策及建议。     

甘薯遗传转化研究现状、问题及展望

甘薯是世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物，由于遗传改良进展缓慢，转基因技术逐渐成为研究的热点，并应用于常规育种中去。到目前为止，甘薯已利用叶片、叶柄、茎、原生质体、愈伤组织、新鲜块根、胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系作为遗传转化受体材料，其中早期以叶片、叶柄为主，目前利用胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系作为转化受体的研究越来越多。用于甘薯遗传转化的方法有农杆菌介导法、电击法和基因枪法，其中以根癌农杆菌介导法为主。最初甘薯遗传转化外源基因表达频率很低，随着转化条件研究的深入，转化频率得到较大的提高，越来越多的目的基因被应用到甘薯遗传转化中去。到目前已有抗虫、抗病毒、抗病、抗除草剂和品质改良等五大类基因转入甘薯基因组中，并且获得了转基因植株。尽管甘薯遗传转化取得了一定的进展，但目前仍缺乏一个有效的遗传转化体系，获得的转基因植株数量有限，还不能应用于生产。存在转化基因型有限、外源基因匮乏、转化方法单一、标记基因存留的问题，以及还不清楚外源基因在转基因植株中的遗传规律等。因此，本文从甘薯遗传转化受体系统、主要转化方法、转化系统以及有益农艺性状基因的应用等对甘薯遗传转化现状进行了综述，分析了目前存在的问题，以及未来甘薯遗传转化研究方向和发展前景。