ITS片段作为轮枝菌DNA条形码的评价研究

以轮枝菌属中的重要植物病原性轮枝菌及其近似种共13种35个菌株为材料,探讨ITS片段作为轮枝菌DNA条形码的可行性。结果表明,ITS 成功区分了研究涉及的10个种,其 PCR 扩增和测序成功率为97.1%,序列鉴定成功率为94.5%,但对个别亲缘关系较近种的物种鉴别能力较弱。     

DNA条形码技术在小花蝽属昆虫分类鉴定中的应用

本研究利用DNA条形码技术对13种小花蝽属Orius Wolff昆虫进行了鉴定,进行了59条COI基因序列碱基组成及种内、种间遗传距离的分析,采用邻接法、最大简约法、贝叶斯推论法构建了系统发育树。结果表明,小花蝽属昆虫COI基因序列碱基组成与典型的昆虫线粒体DNA一致,A+T平均含量(66.4%)明显高于G+C含量,密码子的第3位A+T含量高达90.7%,碱基替换多为同义替换;13种小花蝽种内平均遗传距离为0.008,种间平均遗传距离为0.128,种内、种间遗传距离没有重叠区域。3种方法构建的系统发育树的聚类分析与形态学鉴定结果基本一致,除微小花蝽Orius minutus(Linnaeus)可能存在隐存种现象外,其他同一种群的不同个体单独聚为一支。利用DNA条形码技术对小花蝽属昆虫进行物种快速分子鉴定具有可行性。     

黑麦草属DNA条形码鉴定技术研究

以毒麦、田毒麦、多花黑麦草、多年生黑麦草、硬直黑麦草、高羊茅与狗牙根等禾本科的7种植物为材料,拟采用 DNA 测序、特异性位点比对、种间遗传距离测定、建立系统树等分析候选 DNA 条形码 psbA-trnH 鉴别黑麦草属常见植物的能力。实验结果表明,以 psbA-trnH 为 DNA 条形码时,建立的系统发育树能较好区分毒麦和田毒麦与其他几种植物。psbA-trnH 序列可以作为黑麦草属植物的潜在条形码。     

trnH-psbA序列作为DNA条形码在苍耳属杂草鉴定中的应用

以trn H-psb A序列作为DNA条形码,对从国外截获的9种苍耳属杂草及1种国内苍耳进行物种鉴定研究。采用DNeasy Plant Mini Kit试剂盒进行总DNA的提取,应用通用引物对其trn H-psb A基因进行PCR扩增,测序得到10种苍耳属杂草的trn H-psb A序列,并利用MEGA 7.0软件进行比对分析构建系统进化树。结果显示:苍耳属杂草trn H-psb A基因序列共有543个位点,其中有53个变异位点,31个变异信息位点,22个单突变位点,30个碱基缺失;种间遗传距离为0~0.093,种内无遗传差异;进化树显示10个苍耳物种均处于独立分支,能够利用该条形码对苍耳属杂草进行区分鉴定。     

应用PCR技术检测玉米中的禾谷镰刀菌

本实验通过用PCR方法来实现对禾谷镰刀菌的快速检测,经对霉变玉米样品、玉米茎腐病组织及玉米穗腐病标本的检测,证明该方法是一种高效、灵敏的方法,具有重要的实际应用价值.     

matK序列作为DNA条形码在苍耳属中的应用

以matK序列作为DNA条形码,对从国外截获的7种苍耳属植物进行物种区分鉴定研究,采用DNeasyOPlantMiniKit试剂盒进行总DNA的提取,应用通用引物对其matK基因进行扩增,测序得到7种苍耳属植物的marK序列,利用MEGA5．1软件对这7种苍耳属植物的matK序列进行比对和分析并构建系统树,结果显示：matK序列能从基因位点层面对苍耳属植物进行区分鉴定。     

基于DNA条形码技术对新疆罂粟科部分植物系统发生分析

以新疆地区4属5种罂粟科植物为研究对象,利用DNA测序技术测定植物叶绿体rbcL基因、核基因ITS,并研究将这两种特定基因联合作为DNA条形码在识别新疆地区罂粟科植物的可行性和有效性。对15条新疆罂粟科植物的ITS-rbcL序列进行信息分析,发现其基因片段多态性位点较多,种内平均遗传距离小于种间。另外,以4种毛茛属植物做外类群对31种罂粟科植物进行聚类分析。结果显示:同属植物基本聚在一起,说明这一联合片段用来鉴定罂粟科植物中属的分类阶元是可行的。所选择的ITS-rbcL片段对罂粟科植物的分类鉴定有一定的参考价值。通过研究还发现,新疆鳞果海罂粟与伊犁秃疮花的亲缘关系较该属其他植物更为接近;新疆重点保护植物红花疆罂粟与黑环罂粟为近缘种;rbcL基因由于其保守度较高,并不适合作罂粟科植物的进化标记基因。     

基于RPA恒温扩增技术对大豆尖孢镰刀菌的快速检测

尖孢镰刀菌侵染大豆引起枯萎病,导致大豆严重减产。为实现对大豆上尖孢镰刀菌的快速检测,基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术开展了试验研究,根据大豆尖孢镰刀菌的特异基因设计了正反引物各3个,并通过两两组合筛选出最佳引物对,实现了在恒温（39℃）条件下,反应15～20 min,即可检测90 fg/μL以上浓度的尖孢镰刀菌,且与大豆疫霉菌、大豆灰斑菌等均无交叉反应。本研究建立的大豆尖孢镰刀菌检测法,相较于传统PCR法和实时定量PCR法具有快速、便捷、即时观察的特点,为该病原的快速检测提供了新的技术手段。     

基于DNA条形码技术的湖南省柑橘主产区实蝇幼虫分子鉴定

为明确湖南省柑橘主产区的实蝇入侵为害现状,从该省7个市(自治州)22个地点收集柑橘蛆果中的幼虫,利用DNA条形码技术对其进行分子鉴定,并以DNA条形码序列作为分子标记探究橘大实蝇Bactrocera minax的20个中国地理种群(湖南省6个组群共16个种群、其它3省市4个种群)以及1个印度地理种群间的亲缘地理关系,分析橘大实蝇在我国的遗传进化关系。结果表明,仅采集自邵阳市城步苗族自治县柑橘蛆果中的5头幼虫被鉴定为蜜柑大实蝇B. tsuneonis,其余21个地点采集的595头幼虫均被鉴定为橘大实蝇。21个橘大实蝇地理种群的平均单倍型多样性为0.75,核苷酸多样性为0.0032,核苷酸差异数为2.13,中国所有地理种群均具有较高的遗传多样性;单倍型网络进化图显示湖南、重庆、贵州种群共享的单倍型H3为原始单倍型,表明其为比较原始的种群;AMOVA分析结果显示种群内个体间遗传变异占总体变异的59.04%,是遗传变异的主要来源;遗传分化结果表明湖南省6个组群间均出现了中度至高度的遗传分化,FST在0.0521～0.7795之间。表明DNA条形码技术可用于蜜柑大实蝇和橘大实蝇幼虫的分子鉴定及其种群遗传进化分析。     

利用DNA条形码对10种苍耳属杂草的鉴定

使用ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK等序列对截获的10种苍耳属(Xanthium)杂草进行扩增测序,比较各序列的扩增和测序效率,采用最近距离法和相似性搜索算法评价不同序列的鉴定效率。采用最佳鉴定序列计算种间K2P距离并构建系统进化树。结果表明,ITS、psbA-trnH2个序列的扩增效率和鉴定效率最高;ITS序列的种间变异最大,其次是psbA-trnH序列,matK序列的种间变异最小;ITS序列的NeighborJoining(NJ)树可明显地将不同苍耳属杂草种分开;psbA-trnH序列可明显地将国内苍耳种和检疫性苍耳种分开。说明利用DNA条形码能够准确地鉴别苍耳属杂草,ITS和psbA-trnH序列是鉴别苍耳属杂草较理想的条形码组合。该研究结果为苍耳属杂草的分子鉴别提供了科学依据与新的思路。     

江苏省水稻赤霉病病原菌分离鉴定与致病力分析

为明确江苏省水稻赤霉病的病原菌组成及致病特征,于2018—2019年从江苏省13个市41个县区采集341份水稻样品,采用组织分离法对病原菌进行分离纯化,基于翻译延伸因子（translationelongation factor-1α,TEF-1α）序列分析对分离菌株进行鉴定,通过TRI11基因序列鉴定及产毒力测定对其产毒化学型进行分析,并按照柯赫氏法则对其致病力进行验证。结果显示,从水稻样品中共分离获得病原菌392株,其中亚洲镰刀菌Fusarium asiaticum为385株,禾谷镰刀菌F. graminearum为7株。亚洲镰刀菌分为3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol,3ADON）化学型和雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol,NIV）化学型菌株,分别占亚洲镰刀菌总菌株数的 66.8% 和 33.2%;禾谷镰刀菌均为（15-acetyldeoxynivalenol,15ADON）化学型。产3ADON的亚洲镰刀菌在全省范围内为优势群体,而产15ADON的禾谷镰刀菌仅在淮北地区被发现;产NIV的亚洲镰刀菌对水稻的致病性要显著高于产3ADON的亚洲镰刀菌。不同产毒化学型亚洲镰刀菌对水稻均有一定致病性,但NIV化学型亚洲镰刀菌对水稻的致病力最强。     

芥菜乙醇提取物对西瓜枯萎病菌的抑菌机制

为探究芥菜乙醇提取物对植物病原菌的抑制机理,以西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. niveum为指示菌,以最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)0.5 g/mL为基准,设置0、0.25、0.5和1.0 g/mL共4种处理浓度,通过测定菌丝形态结构、菌液电导率、菌体丙二醛含量、细胞壁相关水解酶活性、呼吸代谢途径酶活性、可溶性蛋白含量及还原糖含量等指标的变化分析其抑菌机理。结果显示,1.0 g/mL芥菜乙醇提取物对西瓜枯萎病菌的处理效果最好,其中,处理后病菌菌液的电导率明显增大,最大可达1.45 ms/cm,是对照组的1.57倍;丙二醛含量达3.16 mmol/g,为对照组的2.24倍;几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性最高,分别为10.57 U/g和14.16 U/g,较对照组分别显著升高了48.04%和17.80%,同时细胞壁降解,使细胞完整性受损;琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶的活性最低,分别为7.33 U/mg和0.28 U/mg,较对照组分别显著下降了73.02%和47.17%;可溶性蛋白和还原糖的含量显著降低,分别为0.44 mg/g和5.34 mg/g,较对照组分别下降了60.71%和56.30%,呼吸能量代谢受阻,抑制菌体生长。表明芥菜乙醇提取物可有效防治西瓜枯萎病。     

糖苷水解酶基因FvGH16-2参与拟轮枝镰孢菌生长发育及致病性

为明确糖苷水解酶16（glycoside hydrolase,GH16）家族基因在拟轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides生长发育和致病过程中的作用,利用生物信息学分析软件对其GH16家族成员进行鉴定,采用转录组分析及实时荧光定量PCR技术对GH16家族成员在不同培养温度下的表达水平进行检测,并通过遗传转化法对家族成员FvGH16-2基因进行敲除及回补,分析其在拟轮枝镰孢菌生长发育及致病过程中的作用。结果显示,在拟轮枝镰孢菌基因组中共鉴定到23个GH16家族基因,其中FvCH16-2、FvCH16-4和FvCH16-12等多个上调表达基因与病菌的生长和抗逆性相关。敲除FvGH16-2基因导致拟轮枝镰孢菌的生长速率及产孢能力降低,细胞壁完整性受损,对H2O2更加敏感,同时对玉米籽粒和茎秆的致病力减弱。表明FvGH16-2基因在拟轮枝镰孢菌生长发育和致病过程中发挥着重要作用,是拟轮枝镰孢菌细胞壁完整性和致病性所必需的。     

检疫性疫霉DNA条形码筛选

 疫霉是世界关注的一类植物病原真菌。以疫霉属80个种122个菌株为研究材料,以ITS、CO1、EF-1α和β-tubulin 4个基因片段为候选DNA条形码,分析表明ITS、CO1基因的PCR扩增和测序成功率最高,分别为100%和96.7%;ITS、CO1和β-tubulin存在明显的条码间隔,但种间、种内距离频率分布存在较小重叠;种间、种内遗传距离Wilcoxon秩和检验结果认为各基因对种内遗传距离的效力相等,对种间遗传距离的区分能力为ITS>CO1>β-tubulin。CO1基因和ITS片段可同时作为11种检疫性疫霉的首选DNA条形码,β-tubulin基因可作为辅助DNA条形码。     

解淀粉芽胞杆菌EA19菌株对小麦赤霉病的防治效果

为明确解淀粉芽胞杆菌Bacillus amylolyticus EA19菌株对小麦赤霉病的防治效果,室内测定EA19菌株及其发酵液对小麦赤霉病菌Fusarium asiaticum菌落生长、孢子萌发、子囊壳形成的影响,以及在室内离体麦穗上的防治效果,并进行了田间小区防治试验。室内试验测定结果表明,EA19菌株发酵液对小麦赤霉病菌菌落生长和分生孢子的萌发具有显著的抑制作用,在室内离体麦穗上的防治效果可达80.0%,对子囊壳形成无显著影响。田间小区防治试验结果表明,在添加紫外保护剂抗坏血酸的条件下,EA19菌株发酵液和菌体悬浮液对赤霉病均有显著的防治效果,其中EA19菌株发酵液的防治效果可达81.2%。EA19菌株喷雾粉可湿性粉剂对赤霉病的防治效果可达67.4%,能使小麦籽粒中脱氧镰刀菌烯醇毒素含量显著降低36.8%,与50%多菌灵可湿性粉剂的效果无显著差异。表明EA19菌株在生产上防治赤霉病具有较大的开发应用潜力。     

糖基转移酶基因TaUGT7分子表达特征及抗赤霉病作用分析

为研究小麦UDP-葡萄糖基转移酶7(UDP-glycosyltransferase 7,TaUGT7)的抗赤霉病功能,利用DNAMAN 6.0软件对Ta UGT7及其同源蛋白进行序列比对,应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析经赤霉菌Fusarium graminearum和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）处理后的苏麦3号小穗中TaUGT7基因的表达特征,利用基因枪在洋葱表皮细胞瞬时表达TaUGT7-eGFP进行亚细胞定位,采用农杆菌介导法在小麦品种Fielder中过量表达TaUGT7基因并进行赤霉病抗性鉴定。结果表明,TaUGT7在氨基酸序列上与已知赤霉病抗性相关UGT相似性较低;TaUGT7在赤霉菌接种24 h后开始被诱导表达,在DON处理2 h后逐步被诱导表达;Ta UGT7蛋白亚细胞定位于细胞膜和细胞核中;qRT-PCR检测发现,TaUGT7在8株独立的过表达转基因株系中均有不同程度的上调表达;与野生型对照相比,过表达株系TaUGT7-395和TaUGT7-457中的平均病小穗率显著下降。...     

土壤环境条件对威百亩熏蒸防治黄瓜枯萎病的影响

为探究威百亩在不同土壤环境条件下的消毒效果,采用离体和活体方法研究施药量、覆膜熏蒸时间、土壤相对含水量及土壤温度对威百亩熏蒸防治黄瓜枯萎病的作用效果。结果表明,25℃条件下,威百亩12 mg(a.i.)/kg土壤熏蒸消毒,对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的抑制率为78.82%,对黄瓜枯萎病的防治效果为87.03%,且对作物安全无药害;威百亩对尖孢镰刀菌的熏蒸抑制作用随着熏蒸时间的增加而增强,土壤熏蒸10 d后对尖孢镰刀菌的抑制率为95.21%;土壤相对含水量为30%和50%时,威百亩对黄瓜枯萎病的防治效果分别为72.32%和82.14%,含水量过高或过低均不利于药效的发挥,而且还会对作物产生药害反应。威百亩的熏蒸效果随着土壤温度的升高而增强,在25、30、35℃时对黄瓜枯萎病的防治效果分别为80.18%、98.20%和100.00%。表明威百亩结合日光消毒温度大于25℃、土壤相对含水量为30%或50%、熏蒸10~15 d可有效控制土壤中尖孢镰刀菌引起的黄瓜枯萎病。     

重庆及周边地区玉米穗腐病致病镰孢菌的分离与鉴定

为明确重庆及周边地区玉米穗腐病致病镰孢菌的种群组成及其分布,于2014—2015年在32个区县98个乡镇采集玉米穗腐病样品,采用种子健康检测法分离病原物,通过形态学特性、培养特征和分子生物学等方法鉴定镰孢菌种。结果表明,在获得的111个镰孢菌分离物中鉴定出10种致病镰孢菌,分别为拟轮枝镰孢、层出镰孢、禾谷镰孢复合种、尖镰孢复合种、藤仓镰孢、木贼镰孢、黄色镰孢、变红镰孢、九州镰孢和茄镰孢,其总分离频率依次为38.70%、17.10%、17.10%、11.70%、7.20%、3.60%、1.80%、0.90%、0.90%和0.90%;除渝东南区域外,在其它区域拟轮枝镰孢的分离频率最高,其次为层出镰孢和禾谷镰孢复合种;对禾谷镰孢复合种分离物的翻译延伸因子TEF-1α基因测序比对发现,该复合种由南方镰孢和亚洲镰孢组成。研究表明,重庆地区玉米穗腐病优势致病镰孢菌为拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种和层出镰孢。     

河北省甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的病原鉴定

为明确河北省甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的症状特点和病原种类,在不同种植区采集储藏期和育秧期病样,描述其症状特征;对病原菌进行分离纯化,采用柯赫氏法则回接验证,依据病原菌的形态特征和基因序列确定病原菌种类。结果表明,在储藏期甘薯发病可导致薯块表面腐烂的占总病薯的59.09%,端部腐烂的占40.91%;薯块带有褐色轮纹病斑的占61.36%,病斑没有轮纹或者轮纹不明显的占38.64%;发病初期薯块内部病斑浅、黑褐色的占27.27%,发病后期薯块内部形成空腔、布满白色菌丝的占72.73%;病斑带有苦味的占59.09%,病斑没有苦味或苦味不明显的占40.91%;在育秧田发病导致薯秧溃疡,表现为主茎基部呈点片发生黑色或者褐色病斑,部分有开裂。分离的病原菌能够同时侵染薯块和薯秧;病原菌单瓶梗产孢,大型分生孢子稍弯,两端钝圆,多数3~7个分隔,顶细胞钝圆,基细胞足跟较明显。其rDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin基因序列与茄镰孢菌Fusarium solani的同源性分别为97%、99%和98%。初步确定甘薯镰孢菌腐烂与溃疡病的病原菌为茄镰孢菌F.solani。