猪传染性胃肠炎病毒在组织细胞上增殖的研究

从组织细胞制备，不同试验细胞及不同维持液组成成份三个方面对ＴＧＥＶ在组织细胞上增殖情况进行了比较。结果表明，用含１５％ＦＢＳ培养液进行了ＳＴ或ｐｋ１５细胞传代并制备悬液，操作方便，能形成良好单层，利用ＴＧＥＶ ＣＰＥ判定；ＳＴ细胞在病毒增殖和检测毒价两方面均较ｐｋ１５细胞分别高２个滴度和１个滴度以上；维护液中提高血清含量或含一定量胰酶对ＴＧＥＶ增殖效果影响不大。     

应用新型CephodexD微载体培养ST细胞增殖CSFV

应用新型CephodexD微载体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟病毒(CSFV),并与常规单层静置培养法进行比较。新型微载体悬浮培养的ST细胞密度72h可达18.9×10~5 cells/mL,是单层静置培养工艺的2倍以上;病毒滴度最高可达7.5×10~5 RID/mL,较单层静置培养法提高了50%;在一个生产流程中,能比传统培养工艺多收获2次合格病毒液。而且,采用新型微载体悬浮培养工艺生产的CSFV,能够刺激猪体产生特异性的中和抗体,对猪的保护率达100%,具有很好的免疫原性。因此,新型微载体悬浮培养工艺较单层静置培养法更有技术优势,在CSFV大规模生产领域具有重要的应用价值。     

猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞中增殖规律的研究

通过孔板培养系统以及微载体和转瓶培养系统，研究了感染复数(MOI)、病毒感染时间(TOI)和病毒维持液对细胞生长和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)繁殖的影响。结果表明，MOI影响细胞生长速率和单位细胞病毒产量，TOI影响细胞对病毒的敏感程度以及胞内病毒的增殖速率；丰富的维生素、氨基酸等物质有利于病毒效价的提高；采用微载体和生物反应器系统生产TGEV，病毒效价可达11．3lgTCID50／0．2mL,北方瓶培养系统提高约100倍。     

猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻疫苗病毒培养条件的优化

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）是引起猪病毒性腹泻的主要病原。猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗应用于预防猪传染性胃肠炎（TGE）及猪流行性腹泻（PED）。在疫苗的生产过程中,要将形成良好单层的细胞进行传代,扩大培养后用TGEV和PEDV两种病毒按5%的接毒量分别感染相对应的ST细胞和Vero细胞单层,37℃条件下培养,繁殖病毒,待细胞病变（CPE）达到80％以上时收获含病毒细胞培养液,病毒液的含毒量应不低于10^7.0TCID50／mL。     

猪传染性胃肠炎病毒弱毒株STC3细胞培养特性及致病性研究

从美国引进的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）弱毒株STC3在ST、PK15及猪肾原代细胞上均能增殖，并产生明显的致细胞病变作用（CPE），其中以ST细胞上的CPE最为迅速、明显，于接毒后20－24h CPE即可达90％－100％，而在PK15及猪肾原代细胞上CPE形成较迟一些，在42－48h可达80％－90％。STC3在ST、PK15及猪肾原代细胞上的TCID50分别为10^-7.67/mL、10^-5.63/mL和10^-5.90/mL。用较大剂量STC3细胞毒经口接种被剥夺初乳的初生仔猪，仅表现为一过性的腹泻而不引起死亡，对3日龄人工哺乳的仔猪则已完全丧失了致病力，但荧光抗体检查结果显示病毒在小肠粘膜上皮细胞中仍有增殖。由此可，STC3可能是1株能很好诱导猪体免疫的TGEV弱毒株。     

猪传染性胃肠炎病毒在组织细胞上增殖的研究

从组织细胞制备、不同试验细胞（ｐｋ１５，ＳＴ）及不同维持液组成成份三个方面对ＴＧＥＶ在组织细胞上增殖情况进行了比较。结果表明，用含１５％ＦＢＳ培养液进行ＳＴ或ｐｋ１５细胞传代并制备悬液，操作方便，能形成良好单层，利用ＴＧＥＶＣＰＥ判定；ＳＴ细胞在病毒增殖和检测毒价两方面均较ｐｋ１５细胞分别高２个滴度和１个滴度以上；维护液中提高血清含量（８％ＦＢＳ）或含一定量胰酶对ＴＧＥＶ增殖效果影响不大。     

应用生物反应器培养ST细胞制备猪传染性胃肠炎病毒

通过生物反应器制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),研究了感染复数(MOI)、微载体浓度、病毒感染时间(TOI)和病毒维持液对病毒效价的影响,结果表明,分别以1:500稀释种毒(8.0 LgTCID50/mL)后接种、接种72 h的ST细胞、5 mg/mL微载体浓度和维持液低糖DMEM+0.2%水解乳蛋白(LH)的参数培养方式效果最为理想。     

pAPN和NEU3的敲除对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)侵染的影响

氨基肽酶(pAPN)是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)侵染的主要受体,为了验证pAPN和唾液酸神经氨酸酶(NEU3)双基因对TGEV入侵机制的影响,应用CRISPR-Cas9基因编辑技术,敲除ST细胞的2个基因pAPN和NEU3。经过病毒感染试验,测定敲除2个目标基因pAPN和NEU3的ST细胞,对病毒的侵染变化以及病毒拷贝数的变化和细胞病变改善,同时监测病毒侵染后纤连蛋白的变化。结果表明,与对照组相比,敲除2个目标基因pAPN和NEU3的ST细胞,明显减轻TGEV侵染引起的细胞病变,TGEV的拷贝数也明显出现下降。此外,同样滴度的TGEV侵染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞后,诱导ST细胞的免疫应答物IFN-β的mRNA水平明显低于野生型ST细胞组。pAPN和NEU3双基因的敲除,明显降低了ST细胞中TGEV的拷贝数,同时也减轻病毒引起的细胞病变,结果证实细胞中的pAPN和NEU3双基因可作为将来养猪生产中抗病毒治疗及抗病品种选育的靶基因。     

猪流行性腹泻病毒在微载体培养Vero细胞上的增殖试验

为了探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)在微载体培养Vero细胞上的增殖效果,采用2 L生物反应器进行微载体培养Vero细胞和PEDV繁殖,并摸索细胞生长和病毒繁殖的最佳条件,检测病毒滴度,与方瓶培养的病毒滴度进行比较。结果显示:当微载体为5 g,种子细胞数约3.05×107个,采用灌注式培养,Vero细胞经72 h长满单层,细胞数约为3.02×109个,此时用滴度为104.45TCID50/m L的PEDV 1 m L感染Vero细胞,培养96 h,微载体上80%细胞脱落时收毒,培养的PEDV具有较高的病毒滴度。相同病毒在微载体系统与方瓶上进行同步传代,经检测病毒滴度均有提高,但在微载体系统上培养的PEDV最高滴度可达到106.05TCID50/m L,明显高于方瓶培养。本试验为研究PEDV能更好适应Vero细胞,提高PEDV产量提供技术支持。     

新型CephodexD微载体在猪瘟病毒大规模增殖中的应用研究

旨在应用新型Cephodex D微载体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟病毒。通过优化工艺条件初步实现了病毒抗原的大规模高效生产,培养过程采用流加方式保证ST细胞的营养供应。用含6%(v/v)无牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)及其抗体的双阴牛血清MEM生长液培养ST细胞。当达到3.8×109个细胞时,接种入生物反应器中,Cephodex D微载体用量为4 g/L。当反应器内ST细胞生长至48 h,接种猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)液。继续培养4 d后进行首次病毒收获,之后每3 d收获1次,直至第5次收毒结束。整个培养过程持续18d,细胞培养至72 h,密度可达2.8×106cells/m L,生产的CSFV滴度均在100万兔体反应量(RID)/m L以上。较现有的国家标准相比,应用生物反应器和新型Cephodex D微载体悬浮培养技术,不仅病毒滴度提高了1倍,而且整个生产周期缩短了5 d,大大提高了生产效率。因此,本研究采用的新型微载体悬浮培养工艺在CSFV大规模生产中具有重要的应用价值。