松墨天牛幼虫cDNA文库的构建及EST分析

松墨天牛（Monlchamus alternatus Hope）是林业重大害虫。本研究运用SMART技术构建了松墨天牛幼虫cDNA文库,库容量为1.09×10^6,文库滴度为5.45×10^6 pfu/mL,重组率为97.8%,平均插入片段大小约为1 000 bp,构建的文库质量较好。随机选取1 022个克隆进行测序,获得了1 012条表达序列标签（ESTs）,序列在GenBank中登录号为JZ143720～JZ144731。EST序列经过聚类拼接得到411条非重复单一序列,其中216条序列有功能注释。在216条有功能注释的序列中,有181条（83.80%）参与＂分子功能＂,122条（56.48%）参与＂细胞成分＂,168条参与＂分子生物学过程＂（77.78%）。研究结果为克隆和分析松墨天牛新的功能基因奠定了基础。     

稻瘟病菌发育cDNA文库构建与表达序列标签分析*

利用稻瘟病菌(Magnaporthegriesa)连续6个发育时期的材料构建了一个混合cDNA文库。文库滴度,重组率和插入片段长度等质量分析表明,构建的文库包含完整的稻瘟病菌基因,可用于病菌基因表达分析。利用该文库获得了7456条5′端表达序列标签(ESTs)(GenBank收录号:(CK909944￣CK913666和CK928583￣CK932582),生物信息分析表明:EST序列拼接出2975个假定独立转录本(TUTs),冗余度为60.1%;从cDNA文库中筛选出大量的低丰度表达基因,约占TUT总数的79.8%,说明在文库中基因组成类型的复杂性较高;在所有TUTs中,功能未知基因约占85.5%,编码ECM33蛋白和疏水蛋白等病菌致病相关的注释基因高丰度表达,进一步表明该cDNA文库反映了病菌侵染和发育过程中基因表达的状况。     

烟草EST数据库构建及cDNA阵列技术建立

一组容量为5 927条烟草(Nicofiana tabacum)EST的数据(GenBank登录号为CV015900～CV021826),包含521个重叠群和3 079个独立EST.EST数据分析显示:高丰度表达基因主要涉及光合代谢、蛋白合成等植物基本的生理功能;而低丰度表达基因则占假定独立转录本(TUTs)总数的85.5%.在此基础上,制备完成cDNA阵列,并应用于盐胁迫下烟叶的基因表达谱分析,结果表明,盐胁迫即可使烟草叶片的基因表达谱发生显著改变,并涉及多个重要的植物生理过程.包括水通道蛋白PIP2a、乙烯应答蛋白酶和mRNA剪接因子prp31等42个基因的检出,为阐明植物胁迫反应的调控机制提供新的线索.     

利用EST序列鉴定葡萄应答外源赤霉素的基因

为了利用NCBI上大量的葡萄(Vitis viniferaL.)EST序列进行葡萄应答外源赤霉素基因的信息挖掘,通过本地化Blast、Blast2go等工具以及其他生物信息学工具和数据库,对NCBI上经过赤霉素(gibberellins,GA)诱导后的葡萄EST序列进行处理,获得了45条仅在赤霉素处理后表达的无冗余EST序列。Blastx注释结果显示,45条序列中有25条序列注释为假定蛋白或未知蛋白(约占55.6%),14条序列无注释信息(约占31.1%),6条序列(13.1%)注释有推定功能,其中包括整合酶蛋白(EE077049)、SPX结构域基因1(EE085000)、丝氨酸羧肽酶类44蛋白(EE091188)、CHY1(EE092187)、假尿苷合酶/转运蛋白(EE106096)、钾离子通道蛋白(EE108944)。Blast2go分析显示,共有29条序列通过基因本体论(GO)注释180个GO号,分属于分子功能(molecula rfunction)、细胞成分(cellular component)、生物过程(biological process)三大类的不同水平。初步推断,在外源赤霉素对葡萄进行处理后,应答基因主要具有结合活性(46.34%)和催化活性(39.02%)两方面的分子功能。其作用空间分布为整个细胞(44.68%)或者细胞器(40.43%)中,并且主要通过参与细胞生理过程(28.57%)和代谢过程(25.71%)等一系列复杂的生理生化反应完成整个应答过程。为进一步研究赤霉素处理后导致葡萄的基因表达情况提供了基本资料。     

大梅与梅山猪背最长肌正反消减文库的构建及序列分析

为从基因差异表达的角度研究杂种优势的分子机理,构建了差减效率均为210倍的大梅与梅山猪背最长肌正反消减文库。在大梅(被消减)-梅山库中挑选了610个有效克隆,经斑点杂交筛选出48个阳性克隆,测序后经Blastn网上比对揭示了37个基因,其中28个EST是已报道基因的cDNA片段,9个在NCBI数据库中没有同源序列。在梅山(被消减)-大梅挑选了580个有效克隆,经斑点杂交筛选出45个阳性克隆,测序后经Blastn网上比对揭示了34个基因,其中26个EST是已报道基因的cDNA片段,8个在NCBI数据库中没有同源序列。     

玉米混合组织的EST文库的构建和部分EST序列的分析

以CLONTEECH的pDNR-LIB质粒为载体,构建了干旱和盐碱共胁迫48h和相应的无胁迫正常生长条件下耐旱玉米(ZeamaysL.)YQ7-96品系的雌雄分化期(12片叶龄)的混合组织(叶、茎和花器)EST文库。该文库容量>2×105个克隆,覆盖了预计的玉米基因组5万个基因的4倍以上。随机对3168个克隆中插入的cDNA进行测序,获得有效序列2098条,其中,2002个克隆中的cDNA进行了5'端测序,96个克隆中的cDNA的进行了5'和3'两端测序。结果表明,3'端测序的96个克隆的cDNA都含有polyA尾巴;进一步对这2098条组装分析,形成168个重叠群(Contig)和1693个单拷贝EST(Singlet),代表了共计1861条独立基因(Unigene);根据GenBank中的玉米EST数据库和BLASTn分析软件进行核苷酸同源性分析,1731条(93.01%)EST的score值大于或等于100,130条(6.99%)的EST的score值小于100,说明这130条属于新的表达基因的序列,有21条可以定位在玉米的不同染色体上;BLASTx分析表明,2098条EST中,1007条(48%)有功能注释信息,1091条(52%)无功能注释信息。该文库中的EST将会对公共数据库中现存的玉米EST数据起到补充作用。     

小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析

以成株期抗条锈小麦(Triticum aestivum)品种兴资9104为材料,依照CLONTECH公司PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit方法构建了小麦成株期条锈菌(Puccinia striiformis)诱导的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库。建库质量分析表明,接头连接效率高,插入片段平均300bp,文库质量较好。对文库中随机挑取的96个阳性克隆进行测序,用CAP3软件聚类拼接,得到unigenes41个。与GenBank已知序列进行Blastx分析表明,所得基因主要涉及植物的信号传导、转录调控、能量与代谢、蛋白质合成与代谢、膜转运、细胞生长分化等。利用RT-PCR对3条基因进行分析,明确其在抗病过程中的表达模式。     

甘薯茎线虫诱导抑制差减杂交cDNA文库的构建及表达序列标签分析

以甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)抗茎线虫病品种鲁薯3号为材料,利用抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了甘薯茎线虫诱导的甘薯块根cDNA文库.从中筛选出1379个阳性克隆进行测序,用CAP3软件聚类拼接,得到185个unique EST.Blast2Go比对ESTs,并进行GO功能分类,结果发现151条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的81.6%.已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、抗病防卫、蛋白质合成等多方面.通过对已知功能的基因进行分析,推测促分裂原活化蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、过氧化氢酶、几丁质酶、葡聚糖酶等可能参与甘薯接种茎线虫后相关的抗性反应.实时荧光定量PCR分析结果表明,与抗茎线虫病相关的4个基因在甘薯接种线虫后不同时间点具有不同的表达模式.     

中国野生葡萄抗白粉病基因RAPD标记的克隆及序列分析

对获得的中国野生葡萄抗白粉病基因RAPD标记OPW02-1756、OPO11-964、OPY13- 661、OPB11- 520、OPW05-766、OPV03-1365和OPJ16-759进行了回收、克隆、测序及序列分析。结果表明,7个RAPD标记的实际长度分别是1756bp、964bp、661bp、520bp、766bp、1365bp和759bp。OPW02-1756序列与3条欧洲葡萄cDNA克隆获得的EST序列有94 ~ 98%的同源性。OPO11- 964序列与欧洲葡萄“赤霞珠”的1条EST序列有93%同源性,与“霞多丽”的2条果实不同发育时期获得的EST序列有90%和87%的同源性,与甜橙在多种病原菌侵染后通过cDNA文库获得的1条EST序列有83%的同源性。OPO11-964最大的一个阅读框架包含444个碱基,编码147个氨基酸,该氨基酸序列和21个其它生物的未知功能蛋白序列有部分相似性。OPY13-661序列与欧洲葡萄16条EST序列有同源性,其中与“赤霞珠”cDNA克隆的EST有较高的同源性, 与“霞多丽”的2条叶片非生物胁迫有关的EST序列同源性均为89%。OPB11-520序列与拟南芥基因组4条未知功能DNA序列有94%同源性。OPW05-766序列与来自于酿酒葡萄的GAG-POL 前提有50%的同源性。OPV03-1365序列与水稻基因组6条序列有81 ~ 88%的同源性,与拟南芥基因组3条序列有84 ~ 91%的同源性。OPJ16-759与欧洲葡萄“霞多丽”叶片14条非生物胁迫EST序列有83 ~ 100%的同源性,与欧洲葡萄“Cabsau”浆果3条水分胁迫的EST序列有94 ~ 100%的同源性。     

中国野生华东葡萄抗白粉病转录因子VpRFP1基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备

为揭示中国野生华东葡萄抗病转录因子基因在与葡萄白粉病互作过程中的作用机制,本研究以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata W.T.Wang)高抗葡萄白粉病株系白河35-1为材料,接种葡萄白粉病菌(Unicinula necator(Schw.)Burr.)病原菌诱导后7个不同时期的反转录产物为模板,用RT-PCR扩增得到V.pseudoreticulata RING-finger protein1基因(VpRFP1)的开放阅读框1053bp;将其克隆到pMD19-T载体经测序后,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia.coli)BL21;经IPTG诱导表达出64kD的融合蛋白GST-VpRFP1,主要以包涵体表达形式存在;采用电透析法纯化融合蛋白,并以纯化产物免疫新西兰大白兔获得抗血清,Western blot检测免疫-抗原反应良好。本研究结果表明,在27℃、0.1mmol/L的IPTG诱导4h融合蛋白GST-VpRFP1的表达量最大,免疫大白兔获得的抗血清能够用于VpRFP1基因的功能分析。     

茶树新梢cDNA克隆测序和表达序列标签(ESTs)特性分析

采用定向克隆法，构建了茶树(Camellia sinensis(L．)O．Kuntze)龙井43和安吉白茶等2个品种新梢cDNA文库。对龙井43cDNA文库共4320个克隆的序列进行了测定，获得有用序列2963个，其中空载体和去除载体后序列短于150bp有416个，重复的有863个，首批共获得1684个茶树ESTs。绝大部分ESTs的长度在300～700bp之间，平均为478bp。通过与NCBI等核酸数据库进行比对、查询和注释，获得已知功能基因或具推测功能的基因130多个(607个ESTs)，新的表达基因1077个，证明ESTs测序分析是一个发现和鉴定茶树功能基因的高效快速新途径。     

黄冠梨几丁质酶基因家族cDNA全长序列克隆与分析

根据已知植物几丁质酶基因序列的保守区域,设计特异性引物,以梨黄冠品种叶片为材料,提取RNA,进行反转录,克隆获得5个几丁质酶基因cDNA片段,进一步通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,依次命名为PyChi1、 PyChi2、 PyChi3、 PyChi4、 PyChi5,序列提交GenBanK,登录号为：FJ589783、 FJ589784、 FJ589785 、 FJ589786、FJ589787。序列分析结果表明,所获得5个几丁质酶基因,都具有完整的ORF和Poly(A)结构,与其他植物几丁质酶基因具有较高的相似性;5个基因的核酸序列的同源性约在35%~53%之间,PyChi1和PyChi4的氨基酸同源性最高,约85%,而与PyChi5约77%;在几丁质酶基因家族,分别属于Chitinase ClassesⅠ-Ⅴ,为5个不同类型的成员;不同类型的几丁质酶基因在核酸和氨基酸序列以及功能结构方面都存在着存在着显著的差异,主要表现在肽链特性和基因结构等方面。这为进一步研究梨几丁质酶的结构和功能奠定了基础。     

大白菜表达序列标签SSR标记分析*

对大白菜（Brassica campestris L．ssppekinensis）13007个EST序列进行拼接共得到7714个片段重叠群（contig），其中10．4％（890个）非冗余EST含有SSR标记（EST-SSR），标记间平均间隔距离为3．9kb，单、双和三核苷酸重复序列大约各占1／3左右。CDS所包含的三核苷酸重复序列最多，而且AAG／CTT重复序列的含量最高。通过同源性比较分析，获得功能已知的SSR-ESTs774个，共计含有846个SSR，其中50．2％位于5＇-UTR，31．4％位于3＇-UTR，18．4％位于CDS。实验选取123个SSR座位设计引物，利用芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的高抗和高感大白菜F6代自交系材料各2份，分析EST-SSR标记多态性。结果表明，其中37个标记可进行有效扩增，但是没有表现出多态性，23个标记（18．7％）至少在1份材料中具有多态性。对这些EST-SSR标记在大白菜和其它芸薹属植物的系统发育关系分析、遗传作图和基因定位的应用进行了讨论。