华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)LMW-GS基因的克隆和序列分析

为了挖掘和利用华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)的优良基因,应用PCR技术对华山新麦草低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因进行了分子克隆和序列分析.结果表明,华山新麦草LMW-GS基因( HS-LMW-1)长度为866 bp,通过提交NCBI进行同源性比较, HS-LMW-1与小麦属LMW-GS基因序列的同源性在83％以上,其中与Thinopyrum intermedium的LMW-GS基因序列(GenBank登录号:AY214454)相似性达92%,进一步将其翻译为氨基酸序列,分析结果显示它具有小麦属LMW-GS序列的典型特征,具有完整的编码区,能够编码274个氨基酸的成熟蛋白,与小麦属Glu-B3和Glu-D3位点编码的LMW-GS基因有很高的一致性,表明 HS-LMW-1基因可能由华山新麦草的Glu-Ns3位点编码.     

华山新麦草特异重复序列的筛选、克隆及Southern杂交分析

为了寻找华山新麦草特异重复序列,以华山新麦草、栽培一粒小麦、栽培二粒小麦、野生一粒小麦、野生二粒小麦、圆锥小麦、阿拉拉特小麦、茹科夫斯基小麦、斯卑尔脱小麦、普通小麦"中国春"(CS)为材料,利用200条RAPD引物筛选出11条华山新麦草特异条带(命名为RHS1~RHS11),并对这些条带进行回收、克隆、测序。将序列在NCBI数据库中进行比对,其中RHS1、RHS2、RHS3、RHS4、RHS6、RHS8、RHS9在NCBI数据库中未发现与其同源的序列。RHS5、RHS7、RHS10、RHS11在NCBI数据库中有相似序列,其最高覆盖度和最高相似性分别为:83%和100%、99%和85%、49%和100%、19%和83%。通过Southern blotting进行序列特异性检测,RHS1、RHS2、RHS4、RHS6和RHS9等5个克隆在10种材料中都没有杂交信号;RHS7、RHS10和RHS11在华山新麦草及其他9种材料中都有弥散分布的杂交信号;RHS3、RHS5和RHS8只在华山新麦草中有杂交信号的序列。这些结果说明RHS3、RHS5、RHS8为华山新麦草基因组特异重复序列。     

华山新麦草居群取样策略的SSR分析

为了研究我国特有植物华山新麦草（Psath yrostachys huashanica Keng）的遗传多样性并获得更为科学、合理的结论,以分布于不同海拔高度黄埔峪（海拔500m）和大夫峪（海拔1218m）的2个华山新麦草居群为研究对象,每个居群分单株采集30株并以6、10、14、18、22、26和30株为单位,利用10对SSR引物对其遗传多样性进行分析。结果表明：（1）分布于较低海拔的黄埔峪居群的平均等住变异数（6．3）和遗传多样性指数（0．713）大于分布于较高海拔的大夫峪居群的等位变异数（5．1）和遗传多样性指数（0．662）;（2）随着分析单位个体数目从6株增加到30株,黄埔峪居群和大夫峪居群的等位变异数（42～63和43～51）和遗传多样性指数（0．643～0．713和0．618～0．662）均表现增大的趋势,但当分析单住的个体数目达到26株以上时,等位变异数和遗传多样性指数基本不再发生变化;（3）当分析单位个体数目为18株时,2个居群的等位变异数和遗传多样性指数分别包含了各自居群95％以上的遗传变异,建议在利用SSR技术进行华山新麦草居群遗传多样性研究中,以单个居群随机采集18株华山新麦草为最佳分析单位个体数目。     

普通小麦-华山新麦草衍生后代的细胞学特点及GISH分析

为了研究华山新麦草染色体在小麦-华山新麦草各衍生世代中的遗传规律并建立一套小麦-华山新麦草异源附加系,对小麦-华山新麦草BC1F2到BC1F5共315个植株进行细胞学检测和GISH分析,结果表明,染色体数目分布范围为40～54,2n≥43的植株有223株,占总观察株数的70.79%;早代植株携带华山新麦草染色体的概率较高,植株染色体数目多大于44,随着自交代数的增加,外源染色体丢失的概率也在增大.因而在选育小麦-华山新麦草异附加系时,在BC1F4和BC1F5世代选择效果较好;通过对染色体数目2n=44的42个植株进行GISH分析,筛选出39个二体附加植株.     

小麦 华山新麦草衍生后代抗旱性分析

为了解小麦-华山新麦草衍生后代的抗旱性,采用籽粒萌发期聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫和幼苗期盆栽控水方法,研究了干旱胁迫对普通小麦7182与华山新麦草的8个衍生后代(B1、B16、B18、B19、B23、B28、B32、A31)籽粒萌发及幼苗保护酶活性等生理指标的影响.结果表明,PEG胁迫对8个衍生材料种子发芽势、发芽率、胚芽和胚根生长均有一定的影响.与无胁迫处理相比,在低PEG浓度下,种子萌发和胚芽及胚根生长变化不明显,高PEG浓度下受到明显抑制,其中B1和B19在种子萌发期抗旱性较强.幼苗盆栽控水后,各材料的SOD、CAT和POD活性均随干旱胁迫程度的增加而增加,其中材料B32的三个指标值最大.各材料的脯氨酸和可溶性蛋白含量对干旱胁迫的反应不一致.通过综合隶属函数法对两个试(实)验的所有指标进行综合评价,不同材料的抗旱性强弱顺序分别为华山新麦草＞B32＞B19＞小偃6号(CK)＞A31＞B23＞B16、B1＞7182＞B18＞B28,说明小麦-华山新麦草衍生后代的抗旱性多数介于两亲本之间,其中B32、B19在籽粒萌发期和幼苗期综合抗旱性较强.     

小麦ramosa2基因的克隆与序列分析

为了研究ramosa2基因在小麦中的功能,以普通小麦(Triticum aestivum L)中国春基因组为模板,玉米、高梁、水稻和大麦中ramosa2基因保守序列为参考设计引物,扩增到1条全长为771 bp的目的片段.序列分析表明,该核酸序列与高梁、玉米、水稻和大麦中ramosa2基因的同源性高达82.9%～95.2%;其预测编码的氨基酸序列与高粱、玉米、水稻和大麦ramosa2基因的氨基酸序列同源性达79.2%～95%.     

核酸酶BN基因的克隆及序列分析

从解淀粉芽孢杆菌中提取染色体ＤＮＡ，经过ＰＣＲ扩增得到Ｂａｍａｓｅ（核酸酶ＢＮ）基因，然后克隆到质粒Ｐ＾ＧＥＭ－７２ｆ（＋）的Ｓｍａｌ位点上并进行序列分析。结果表明，核酸酶ＢＮ基因的核苷酸序列与已报道的序列相比具有９９．７％的同源性，长度为３３６ｂｐ，根据核苷酸序列推断的氨基酸序列则完全一致。该工作为以后利用核酸酶的特异表达来获得雄性不育植物打下了基础。     

黑皮冬瓜NBS类抗病基因同源序列克隆与分析

以黑皮冬瓜"B98K"种质为试材,根据已克隆的植物NBS类抗病基因保守结构域设计简并引物,PCR扩增冬瓜基因组DNA,获得对应区段的DNA片段,回收克隆与测序后,得到19条抗病同源序列(命名为DNB1至DNB19)。利用DNAStar软件进行序列分析及同源性比对发现,这些抗病同源序列长度在249~252 nt之间,其核苷酸序列同源性在48.4%~98.8%之间,氨基酸序列同源性为23.2%~100.0%,推导氨基酸序列具有P-loop(GGVGKTT)、Kinase-2a(VLDDVW)典型的NBS保守结构域。同源进化分析将其全部归为non TIR-NBS-LRR类,与推导氨基酸序列多重比较结果一致;该序列与其他作物已克隆抗病基因的氨基酸序列同源性在24.7%~99.0%之间。该组序列已登录Genbank,登录号为KF776401~KF776419。     

拟南芥Lfy基因的克隆及全序列分析

以拟南芥花蕾为材料，对Ｌｅａｆｙ基因进行了克隆和全序列分析。结果表明，该基因全长１２６３ｂｐ，共编码４２０个氨基酸，与国外已报道的序列相比较，具有９９．７８％的氨基酸同源性。     

普通小麦和华山新麦草衍生系H9021对全蚀病抗性的遗传分析

为了解普通小麦和华山新麦草(Psathyrostachys huashanica,2n=14,NN)衍生系H9021对全蚀病抗性的遗传特点,利用IECM算法对H9021×96(15) F2分离群体的抗病性进行了估算[96(15)为感病材料].结果表明,H9021对全蚀病抗性的遗传模型为B-1,即抗性由两对主基因+多基因控制,主基因表现为加性-显性-上位性模型,两个重复中F2群体控制抗性的主基因遗传率分别为96.7%和94.6%.     

普通小麦 华山新麦草衍生后代H18和0841的SSR标记鉴定

为了明确普通小麦华山新麦草衍生后代材料中所携带的外源遗传物质,利用SSR标记对普通小麦-华山新麦草衍生后代H18和0841进行了鉴定.SSR标记结果表明,331个SSR标记中有271个在亲本华山新麦草和普通小麦7182间具有多态性;85个在华山新麦草中具有清晰且明亮的特异条带,其中9个标记在H18衍生的8个单株中(2n=51～54)具有华山新麦草特征条带.0841的染色体数目为42条,利用筛选的9个标记对其鉴定,发现定位于小麦3D染色体上的标记Xbarc71在0841中具有华山新麦草的特异条带,同时缺失小麦亲本7182的特异条带,推测0841可能是华山新麦草的3Ns染色体代换了小麦的3D染色体.条锈病抗性鉴定显示,0841中抗至高抗条锈菌条中31号和条中32号混合小种.     

华山新麦草3Ns染色体特异SCAR标记的开发

为快速准确地建立小麦-华山新麦草杂交后代的分子标记鉴定方法,采用150条10bp的随机引物R1-R150对华山新麦草、普通小麦7182、中国春及华山新麦草1Ns-7Ns全套二体附加系共10个材料进行了RAPD分析,从中获得了华山新麦草3Ns染色体上2个特异RAPD分子标记片段FR-113和FR-125。克隆这两个片段并测序,发现其全长分别为543bp和515bp;分析序列后对其分别设计SCAR引物S-113和S-125,重新对10个材料进行SCAR分析,结果只在华山新麦草和小麦-华山新麦草3Ns二体附加系上扩增出了特异条带,由此证明已将华山新麦草3Ns染色体上获得的两个RAPD标记成功转化为稳定可靠的SCAR标记。这两个SCAR标记可用于检测小麦背景下的华山新麦草3Ns染色体,同时为小麦-华山新麦草杂交后代提供了分子鉴定依据。     

附加华山新麦草不同Ns染色体对小麦耐盐性的影响及其生理机制分析

为了解附加华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)不同Ns染色体对小麦耐盐性的影响及其相关生理机制,以小麦-华山新麦草全套二体附加系及其亲本7182为研究对象,对其进行150 mmol·L^-1、250 mmol·L^-1 NaCl溶液胁迫处理,测定其芽期和苗期的7个生长指标及6个理化指标,并进行分析比较。结果表明,盐胁迫下,供试材料芽期的芽长（SL）和根长（RL）、苗期的叶片鲜重（FW）下降最为明显;4Ns、5Ns、7Ns附加系在芽期、苗期的耐盐性显著高于受体小麦7182,其中7Ns附加系耐盐能力最强,150 mmol·L^-1和250mmol·L^-1NaCl胁迫下,耐盐等级分别为Ⅰ级（高耐）和Ⅱ级（耐盐）。盐胁迫下,5Ns、7Ns附加系叶片内SOD、POD活性最高,且叶片丙二醛（MDA）含量最低,相对电导率最小;4Ns附加系脯氨酸含量较高,丙二醛含量较少。可以认为,华山新麦草4Ns、5Ns、7Ns染色体附加到小麦后,分别依赖渗透调节、抗氧化机制增强受体小麦的耐盐能力,这些附加系材料可作为新种质应用于小麦耐盐性研究和育种。     

小麦耐冷相关基因TaCTR的克隆及其表达特性分析

低温冷害是小麦生长发育过程中面临的重要非生物逆境因素。为了挖掘小麦耐冷功能基因,本研究采用同源克隆的方法从普通小麦品种小偃22中分离到一个耐冷相关基因TaCTR,该基因序列全长2 192 bp,含有12个外显子、11个内含子,编码区全长为1 407 bp,编码468个氨基酸,分子量约为53.43 kDa;系统进化树分析表明,该基因在进化关系上与山羊草最近;亚细胞定位结果显示,该基因编码的蛋白为膜蛋白;实时荧光定量PCR（RT-PCR）结果表明,TaCTR在不同品种、不同组织和不同发育阶段低温特异表达;在干旱、高盐及GA处理下,TaCTR的表达量显著上升,说明该基因可能参与调控小麦的抗逆反应。     

小麦CO-like基因TaCO9的克隆及分析

CO蛋白(CONSTANS)是光周期途径中重要的调控因子,为了从普通小麦中进一步挖掘COlike基因,利用同源克隆的方法得到与大麦HvCO9基因同源的小麦TaCO9基因。结果表明,在冬性品种西农889中,初步克隆得到TaCO9基因的三个同源序列,分别命名为TaCO9-1、TaCO9-2、TaCO9-3。其cDNA序列全长均为870bp,开放阅读框为1 977bp,编码289个氨基酸,含有CO-like蛋白家族典型的CCT结构域,但不含B-box结构域;而在春性品种中发现TaCO9-1序列的第二外显子区域有6个碱基的插入,利用中国春缺-四体材料将该序列定位于小麦的1A染色体,命名为TaCO9-1A。系统发育分析表明,TaCO9蛋白与水稻Ghd7及大麦HvCO9位于同一分支。空间结构分析表明,其CCT结构域的NF-YA2区域较为保守,而该区域与CCAAT box互作相关。本研究克隆得到的TaCO9基因可能是小麦CO-like基因家族的新成员,与大麦HvCO9基因的结构相似,可作为新的小麦光周期候选基因加以研究利用。     

小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

华山新麦草2Ns染色体SCAR标记的开发

为准确快速地建立小麦-华山新麦草杂交后代的分子标记鉴定方法,利用180条长度为10bp的随机引物R1～R180对小麦-华山新麦草全套(1Ns～7Ns)二体附加系及其亲本华山新麦草和普通小麦7182共9个材料进行了RAPD分析。结果表明,R131在华山新麦草和小麦-华山新麦草2Ns二体附加系中可以扩增出特异条带。将该特异条带回收并测序,发现其全长为1 126 bp,对其进行序列比对分析后设计SCAR引物S131,然后利用S131重新对9份材料进行了SCAR分析。结果显示,S131只在华山新麦草和小麦-华山新麦草2Ns二体附加系中扩增出特异性条带,表明RAPD标记R131已成功转化为可靠、特异的SCAR标记S131。这个新的SCAR标记可用于检测普通小麦背景下华山新麦草2Ns染色体。     

三个小麦-华山新麦草二体附加系分子细胞遗传学的初步鉴定

华山新麦草是我国华山地区特有小麦近缘物种,具有抗逆、早熟、优质等特点,对小麦的白粉病、条锈病、赤霉病也具有良好的抗性,是小麦重要的三级基因库。为进一步更好地发挥华山新麦草基因资源的作用,本研究利用细胞学方法、原位杂交技术、分子标记技术、农艺性状评估和抗病性鉴定对普通小麦-华山新麦草衍生后代材料进行鉴定,并获得了 20H11、17H21、18H28 三个小麦-华山新麦草衍生系。结果表明,20H11、17H21 和 18H28 的染色体数都是 44 条,均携带2 条属于华山新麦草的 Ns 染色体和 42 条普通小麦染色体。利用华山新麦草的特异分子标记进行检测,证明 20H11、17H21 和 18H28分别为 3Ns、4Ns和 2Ns二体附加系。通过农艺性状调查,3个试验异染色体系与亲本7182相比,株高和小穗粒数的差异不显著;分蘖数目与亲本7182有显著差异;20H11的穗长显著短于亲本7182;17H21的分蘖数显著少于亲本7182。经条锈病抗性鉴定,18H28 高抗条锈病小种 CYR32 和 CYR34。因此,这三个华山新麦草衍生系可作为中间材料用于小麦遗传育种研究。     

小麦抗逆相关基因 TaGB1的克隆及其表达特性分析

为了解小麦的 TaGB1基因特性、表达情况及其与双子叶植物同源基因的进化关系,以小麦品种济麦22为研究对象,采用同源克隆的方法获得小麦G蛋白β亚基编码区序列, TaGB1编码区全长1 143 bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41 kD,基因组序列中包含6个外显子和5个内含子,分别位于小麦基因组的4A、4B、4D染色体上,不同拷贝的氨基酸同源性高达99.91%。 TaGB1基因结构中包含7个WD40保守域,表达产物位于胞质和质膜上。经系统发育进化关系分析,单子叶植物与双子叶植物的G蛋白β亚基分化形成两大分支; TaGB1在进化关系上与单子叶植物较近,而与拟南芥等双子叶植物较远。 TaGB1在ABA、盐、热和干旱胁迫条件下上调表达,植物的根、茎、叶等部位均有表达,叶片中表达量较高,说明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦-华山新麦草异附加系的细胞遗传学和分子标记辅助鉴定

华山新麦草(2n=2x=14,NsNs)含多种优良基因,是一类具有广阔应用前景的育种资源。为给小麦育种培育新材料,本研究对来自普通小麦品系7182和华山新麦草的高代衍生系H1133、H4122和H1423进行细胞遗传学和分子标记辅助鉴定。细胞学观察表明,3个衍生系的染色体数和构型均为2n=44=22Ⅱ;基因组原位杂交(GISH)和荧光原位杂交(FISH)同步分析结果表明,3个衍生系均含42条普通小麦染色体和2条华山新麦草Ns染色体;EST和PLUG标记分析证明H1133、H4122和H1423中附加的分别为华山新麦草3Ns、5Ns和7Ns染色体,说明H1133、H4122和H1423分别为小麦-华山新麦草的3Ns附加系、5Ns附加系和7Ns附加系;形态学鉴定结果表明,三个附加系与亲本7182在株高、分蘖和穗长等农艺性状上表现出不同差异;成株期抗条锈病鉴定结果表明,H4122和H1423高抗CYR32和CYR33混合菌种,从材料系谱推断其抗性来源于华山新麦草。总之,附加系H1133、H4122和H1423在农艺性状和抗病性上均有良好表现,可作为小麦育种中的桥梁材料。