刺激植物响应蛋白基因Epl1克隆、原核表达及功能初探

目的研究刺激植物响应蛋白Epl1对木本植物山新杨的刺激响应功能, 为开发新一代提高植物免疫的新型诱导剂奠定基础。方法从棘孢木霉ACCC30153菌株中克隆获得一个刺激植物响应蛋白基因Epl1, 并进行序列分析和原核表达, 将获得的原核重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗进行互作, 初步探讨rEpl1蛋白对山新杨生长、生理指标、以及生长和防御相关基因转录水平的影响。结果刺激植物响应蛋白基因Epl1的cDNA序列全长为417 bp, 预测蛋白分子量12.6 kDa, 属于Cerato-platanin家族; 通过构建原核表达载体, 成功获得重组蛋白rEpl1;在1 μg/mL rEpl1诱导下, 山新杨组培苗生长较快、根系旺盛, 生物量明显增加, CAT活性在诱导第1 d时为对照的3.51倍, 可溶性糖含量和脯氨酸含量在诱导初期急剧积累; 山新杨生长素基因LAX2/AUX和水杨酸防御基因JAR2的转录水平分别在蛋白诱导2 d和12 h时达到峰值, 分别为对照的873.10和388.02倍。结论Epl1基因的克隆、序列分析和原核表达为进一步研究Epl1蛋白诱导植物系统抗病性提供了理论基础; 重组蛋白rEpl1与山新杨组培苗互作实验, 初步Epl1蛋白能够刺激木本植物在生理及分子水平上的响应, 从而促进生长, 提高抗性。      

人视黄醇结合蛋白基因的毕赤酵母表达载体构建

用PCR方法从pGEX-hRBP中扩增人视黄醇结合蛋白(retinol bingding protein，prop)，用限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9，然后用T4连接酶将目的片段克隆到pPIC9载体中。分别用PCR方法和酶切方法验证了此载体构建成功，为下一步使用毕赤酵母进行真核表达人视黄醇结合蛋白打下基础。     

甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC 57质粒中测序后,用EcoR I 和Not I双酶切,连接到pPIC 9 k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His+Muts重组子.0.5%甲醇诱导表达96 h后,对发酵液和细胞进行SDS-PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6.0 kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符.用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329 mg/L.     

甜味蛋白Brazzein基因的合成及在毕赤酵母中的表达

用连接PCR合成出甜味蛋白Brazzein的基因,克隆到PUC57质粒中测序后,用EcoR I和Not I双酶切,连接到pPIC9k,电转化毕赤酵母GS 115,经MD和MM平板筛选,获得His^ Mut^ 重组子。0．5％甲醇诱导表达96h后,对发酵液和细胞进行SDS—PAGE分析,在发酵液中没有蛋白带出现,在细胞裂解液中出现相对分子质量约6．0kd的特异性甜味蛋白条带,与预期的相对分子质量大小相符。用BCA蛋白定量试剂盒测定,Brazzein在毕赤酵母中的表达量可达329mg／L。     

水稻寡肽转运基因OsPTR1～10酵母异源表达载体的构建及转化

[目的]研究水稻中的10个寡肽转运同源基因的功能。[方法]将10个OsPTR基因的开放读码框插入到酵母异源表达载体pDR196中．并将它们转入寡肽转运功能缺失的酵母突变体中,进而测试这些基因的寡肽转运功能。【结果]实际酶切结果与预期酶切结果完全一致,说明目的基因已经成功克隆到酵母穿梭表达载体上。在酵母菌株的营养缺陷型测试中,完全培养基中的所有菌株生长良好;菌株ABC154和ABC738在缺乏Ura、Leu、Lys、His、Trp或Ade的培养基中不能生长,说明菌株ABC738和ABC154是Ura、Leu、Lys、His、Tm和Ade的营养缺陷型菌株,可以用于测试目的基因的寡肽转运功能。菌株pDR196／OsPTR1～10／ABC738和pDR196／ABC738在缺乏Ura的培养基中生长良好。说明质粒pDR196上有Ura基因。[结论]该试验为寡肽转运基因的研究提供了方法支持。     

草莓果实FaRIPK1蛋白的酵母外源表达及验证

[目的]类受体蛋白激酶在植物的生长发育及果实成熟过程中发挥重要作用,而植物中已鉴定的类受体激酶绝大多数属于LRR型.为了得到草莓中LRR型蛋白激酶FaRIPK1,从而进一步研究其功能.本实验采用真核表达的方法诱导表达FaRIPK1蛋白质,以期确定其最佳的诱导表达时间.[方法]以‘童子一号’草莓果实为试验材料,扩增出FaRIPK1基因的功能区序列,构建真核表达载体pPICZB-RIPK1后转入酵母表达菌株X-33诱导表达,通过在0,12,24,36 h处取样检测FaRIPK1蛋白质的表达情况并采用Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化得到目的蛋白,纯化后的FaRIPK1蛋白质再进行Western-blot验证.[结果]重组表达菌株经过BMMY诱导培养基诱导24 h后FaRIPK1蛋白质的表达量达到最高值,此时最利于FaRIPK1蛋白质的纯化.Western-blot验证表明所得蛋白质确为FaRIPK1蛋白质.[结论]确定了诱导表达后24 h为FaRIPK1蛋白质真核表达的最佳时间,为进一步研究FaRIPK1蛋白质的功能奠定基础.     

深绿木霉1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶基因的克隆及表达

以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153为试材,应用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶ACCD基因的c DNA全长。结果表明:此基因的c DNA编码区序列全长1 083 bp,编码区可编码360个氨基酸。经Blast P相似性分析,其属于Try-synth-beta-Ⅱ家族,与里氏木霉(T.reesei)氨基酸序列XP-006967764的同源性最高,达到91%。在5种不同诱导条件下,ACCD基因的表达量均有明显变化。在C、N饥饿培养基中分别培养8 h与16 h时,ACCD基因表达量达到最大值,为未诱导时的22.7倍与22.4倍;在山新杨叶粉与茎粉的诱导下,ACCD的表达量分别在培养的24 h与2 h达到最大,为未诱导的22.6倍与27.3倍。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白（Coat Protein CP）和移动蛋白（Movement Protein MP）基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物。通过PCR扩增获得含有目的基因的片段，经过SalⅠ和PstⅠ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。     

猪hepcidin基因质粒载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

为构建猪hepcidin毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体,实现其真核表达,本文采用RT-PCR方法获得猪肝脏中的铁代谢调节基因hepcidin,通过连接酶使其与真核表达载体pGAPZaA相连构建重组表达质粒pGAPZaA-hepcidin。利用高压电击处理,使质粒载体转入到毕赤酵母中,用含Zeocin抗生素的YPD平板筛选阳性转化子,并做PCR鉴定。结果表明:hepcidin基因准确地插入表达载体pGAPZaA,并已整合到酵母基因组中,并成功构建了酵母重组表达质粒。     

His标签的水稻硅转运蛋白表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过MD/MM板筛选出甲醇利用快型的酵母转化子,再通过不同浓度梯度的G418平板筛选多拷贝转化菌株.提取酵母基因组,PCR验证正确的菌株即为工程菌(GS115/p PIC9k-Lsi1).用1%甲醇诱导该工程菌72 h后,收集上清,经SDS-PAGE检测到位于32.8 ku处的目的蛋白即为Si转运蛋白(Os Lsi1).     

凋亡抑制蛋白基因dsRNA转基因烟草表达载体的构建

为了利用RNA干扰技术防治烟粉虱,需要构建凋亡抑制蛋白(IAP)基因dsRNA转基因烟草表达载体。利用PCR技术扩增烟粉虱IAP基因,将其连接到pMD18-T载体中,用BglⅡ、XhoⅠ和BamHⅠ、SalⅠ分别酶切,将获得的片段分别反向、正向连接至pUC-RNAi载体,用PstⅠ酶切pUC-RNAi-IAP,回收酶切片段,将其连接到表达载体pCAMBIA-2300-35S中,并进行酶切验证。IAPdsRNA转基因烟草表达载体的成功构建为下一步转基因烟草防治烟粉虱的研究奠定基础。     

玉米蛋白激酶基因ZmASK1表达载体的构建及遗传转化

为了研究玉米蛋白激酶基因ZmASK1的功能,把ZmASK1的cDNA连接到植物表达栽体pGreen0029中,通过农杆菌介导转入拟南芥中进行过量表达.PCR和Western-blot分析表明,ZmASK1已经转入到拟南芥中,并且在大多数转化植株中稳定表达.通过本试验,为以后对ZmASK1的功能验证工作打下基础.     

甜味蛋白Brazzein基因酵母表达系统的建立

根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列,结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸(29Asp→Lys,31His→Ala,41Glu→Lys)。采用重叠PCR(SOE-PCR)合成目的基因并克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定,序列正确的质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切。将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上,经PCR、酶切和测序鉴定,证明已成功构建pGAPZαA-Bra真核表达载体。将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化,电转进入巴斯德毕赤酵母中。筛选ZeocinTM阳性克隆菌,进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明蛋白表达成功。     

天麻抗真菌蛋白cDNA克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术扩增出天麻抗真菌蛋白(Gastrodia antifungal protein,GAFP)的cDNA序列,通过pGM-T载体转入大肠杆菌JM109克隆,在培养基上筛选重组质粒酶切鉴定,阳性克隆经限制性内切酶Xba1和Sac1酶切与同样酶切的植物表达载体pBI121连接,构建天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体pBI121-GAFP。结果,天麻抗真菌蛋白(GAFP)的植物表达载体构建成功。     

FaDREB1基因RNAi的植物表达载体的构建

以pMD18-T-FaDREB1为基础,构建了由35s启动子调控的FaDREB1基因RNAi的植物表达载体pART27-FaDREB1(1)-FaDREB1(2),并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LB4404中。对于研究RNAi的机理和应用以及研究DREB类转录因子基因的功能和应用具有重要的理论价值。     

大豆GmF-box基因植物表达载体的构建及转化拟南芥

为了研究大豆(Glycine max)Gm F-box基因的功能,以含有Gm F-box基因全长c DNA序列的p JET1.2-Gm F-box质粒为模板,通过PCR扩增获得Gm F-box基因的c DNA序列,并将该基因构建到植物表达载体p EGAD中,构建了由Ca MV35S启动子驱动Gm F-box基因的植物表达载体p EGAD-Gm Fbox,利用冻融法转入农杆菌GV3101菌株,通过农杆菌浸染方法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。通过除草剂筛选和PCR检测转基因拟南芥,初步证明已获得转大豆Gm F-box基因的拟南芥。     

植物蛋白融合HA标签通用载体构建与应用

以植物表达载体pCamE(GenBank No.:JX841315)为基本骨架,HA蛋白YPYDVPDYA为标签序列,构建可分别融合目标蛋白N端与C端表达载体pCHAN与pCHAC,并增加有利外源基因插入的酶切位点,使之成为含有7个常见限制性内切酶(PstⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ、Bam HⅠ、KpnⅠ、SmaⅠ、ApaⅠ或SalⅠ)单一识别位点的通用型标签载体;为验证该载体实用性,将项目组自主克隆的大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP14(GenBank No.:JN967626)连接至上述载体,并转入拟南芥;经PCR检测与测序分析获得T2转基因株系,HA标签抗体Western blotting结果发现转pCHAN-GmPAP14、pCHAC-GmPAP14拟南芥可获得目的蛋白融合HA标签杂交条带,而对照无该条带出现,证明2个HA标签载体能够稳定融合外源基因编码蛋白N端与C端,且可在转基因植物中正常翻译表达,为植物蛋白分离纯化及相关领域研究提供了稳定可靠的通用型融合标签载体资源。     

小菊'类锌指蛋白'基因植物表达载体构建及对烟草的转化

为了建立耐盐碱小菊(Chrysanthemum morifolium)中克隆到的'类锌指蛋白基因'CmSTZF(DQ864730)的烟草遗传转化体系,并研究其抗逆特性。本研究借助Gateway技术构建了小菊'类锌指蛋白'基因CmSTZF的过量表达载体pH7WG2D-CmSTZF,并以烟草NC89(N.plumbaginifolia'NC89')的叶片为试材,通过农杆菌介导的转化,成功地建立了烟草遗传转化体系,经PCR-Southern鉴定获得CmSTZF的转基因烟草株系。     

拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建

拟南芥氨基酸透性酶1(AAP1,也叫NAT1)是植物中第一个被分离的氨基酸转运蛋白,在拟南芥主根、侧根、根毛及根表皮细胞中均有增加氨基酸含量的作用。本研究利用RT-PCR的方法,从拟南芥中克隆了该基因,测序结果与GenBank(NM-104616.4)中已发表的拟南芥AAP1(AtAAP1)基因的同源性高达99.93%;并将AtAAP1基因与pCAMBIA3300构建p3300-AAP1植物表达载体,为过表达AtAAP1基因,提高作物氨基酸含量,从而改善作物氮素利用效率提供参考。     

玉米ZmbZIP基因植物表达载体的构建

根据玉米(Zea mays)Zmb ZIP的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pGM-T-ZmbZIP为模板PCR扩增ZmbZIP基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建该基因的植物表达载体.结果表明,扩增出的ZmbZIP基因片段长度为894 bp.经PCR检测及测序鉴定,表明植物表达载体构建成功,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.