嗜水气单胞菌临床分离株胞外毒力因子的检测

嗜水气单胞菌在自然界，尤其是水环境中广泛存在，其毒力菌株能够引致人和多种动物传染性疾病，在公共卫生上占有一定的地位。自20世纪90年代以来引起的我国淡水养殖鱼类的暴发性败血症，造成重大的经济损失。嗜水气单胞菌有致病性与非致病性菌株之分。嗜水气单胞菌在生长繁殖过程中，不断地向外界环境中释放代谢产物，这对于细菌消化吸收营养物质、吸附、侵袭宿主细胞，在宿主体内定居、繁殖以及抵抗宿主免疫系统都有极其重要的意义。     

鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定

从陕西省甘养殖场送检的病鱼中分离到1株革兰氏阴性杆菌，培养特征观察笔生化特性分析结果证实为嗜水气单胞菌；小鼠和金鱼致病性试验证实分离菌具有致病性；药敏试验结果表明该菌对链毒素、万古霉素等高度敏感，对羧苄青霉素、氟哌酸等不敏感。用该菌制成灭活免疫金鱼保护力可达到80％以上。     

嗜水气单胞菌疫苗的研制

取致病性嗜水气单胞菌（Ａｈ）Ｊ－１株接种改良肉汤，摇床培养１８０ｒｐｍ２８℃２４ｈ，用福尔马林灭活制得全菌苗。另将上述培养物离心，取上清经福尔马林灭活制得毒素苗。用全菌苗和毒素苗分别免疫小鼠，２周后强化免疫，而后用Ｊ－１株５０ＬＤ＿（５０）腹腔注射攻击，免疫组均保护，对照组全部死亡。在鲫鱼的免疫保护试验中，分别采用全菌苗及毒素亩作腹腔注射或浸泡免疫，４周后强化免疫。用ＡｈＪ－１株５０ＬＤ＿（５０）腹腔注射攻击。结果全菌苗注射组保护８７％（１３／１５）；毒素苗注射组保护４０％（８、２０）；全菌苗浸泡组保护４０％（６／１５）；毒素苗浸泡组保护６７％（１０／１５）；对照组全部死亡。免疫持续期试验表明，在两次免疫６个月后攻击，全菌苗或毒素苗均仍显示一定的保护力。在平均水温２７℃±２℃下，鲫鱼的抗体动态为：全菌苗注射免疫组在强化免疫后１周全菌凝集抗体达２￣６，此时可检测到鲫鱼体表粘液中有低滴度凝集抗体存在，较高滴度的血清凝集抗体至少可维持６个月。全菌苗浸泡组在强化免疫后约１０天血清中才出现凝集抗体，滴度较低。毒素苗注射免疫用的毒素溶血抑制抗体在初次免疫第２８天达２￣７，强化免疫后高滴度抗体可维持１７天；毒素苗浸泡组的?     

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

根据我国致病性嗜水气单胞菌分离株AH－78－2气溶素（Aer）基因保守区的测序结果，设计2对引物，建立了检测嗜水气单胸菌的PCR方法，通过对20株嗜水气单胞菌，12株相关菌株及157份送检病料的检测，并与SPA－CoA检测结果对照表明，PCR方法具有较高的敏感性和特异性，可检测最低100cfu的细菌，该方法的建立为致病性嗜水气单胸菌的检测提供了一种简便，快速的新途径，以我国分离株的序列设计引物使该法具有更强的针对性。     

疑似草鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

试验对疑似嗜水气单胞菌草鱼的肝脏、脾脏、肾脏组织进行嗜水气单胞菌的分离鉴定。通过普通营养琼脂、胰蛋白大豆琼脂及生化试剂等的分离培养与生化鉴定后,获得3株细菌;16S rRNA通用引物检测3株细菌的基因序列比对确定菌株后,对确定的草鱼嗜水气单胞菌进行回归试验确认其致病性,然后采用临床上常用的阿奇霉素、阿米卡星、链霉素等10种抗生素进行药敏试验。结果表明,经过分离培养、生化鉴定及16S rRNA通用引物鉴定后确定3种菌株分别为嗜水气单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和腐败斯瓦尼菌,确定的嗜水气单胞菌回归试验证明其具有致病性;药敏试验显示阿奇霉素对腐败斯瓦尼菌和嗜麦芽窄食单胞菌敏感,其抑菌直径分别为105、95 mm,阿米卡星对嗜麦芽窄食单胞菌、嗜水气单胞菌和腐败斯瓦尼菌这3种菌都较敏感,抑菌直径分别为105、95和93 mm。结果表明,疑似为嗜水气单胞菌病的草鱼有3种细菌感染,其中鉴定的嗜水气单胞菌是致病菌,常用抗生素阿米卡星对3种菌都有抑制作用,而仅对腐败斯瓦尼菌和嗜麦芽窄食单胞菌敏感的是阿奇霉素。     

南京地区池塘水中嗜水气单胞菌的分离鉴定与相关毒力基因检测

嗜水气单胞菌在自然界广泛存在,是一种典型的人-兽-鱼共患病病原菌。本研究收集南京市多处湖泊池塘水样,采用增菌、平板分离培养、生化试验和种特异性16S rRNA基因扩增等进行嗜水气单胞菌的分离鉴定;采用PCR技术检测分离株毒力基因的分布,进一步通过动物试验确定是否为致病性菌株。结果,从28份水样中共检出嗜水气单胞菌7株,检出率达25%;其中致病性菌株4株,占被检嗜水气单胞菌总数的57.14%(4/7)。本研究有助于了解南京市水体环境中嗜水气单胞菌的污染情况,为进一步预防该菌所引起的相关疾病的发生和传播提供理论依据。     

嗜水气单胞菌重庆WL3-X2分离株灭活疫苗对大鲵的免疫保护效果的研究

为评估重庆地区分离的嗜气单胞菌WL3-X2分离株对大鲵的免疫原性,本研究将嗜水气单胞菌WL3-X2分离株经福尔马林灭活,作为免疫原,通过腹腔注射途径间隔2周两次免疫健康大鲵,并检测其体内血清抗体、溶菌酶、补体C3及其免疫保护效应。结果显示,免疫嗜水气单胞菌灭活菌能够显著提高大鲵血清抗体滴度、溶菌酶活性和补体C3含量,首免35 d后这3项指标均达到峰值。此外,对初免4周后的大鲵经肌肉注射0.2 m L浓度为1.0×10~8 cfu/m L剂量的嗜水气单胞菌WL3-X2分离株,进行攻毒保护试验。结果表明,免疫组的相对免疫保护率为66.7%。本研究结果表明,嗜水气单胞菌地方分离株灭活菌对大鲵具有显著免疫保护效力,可以作为大鲵预防嗜水气单胞菌感染的候选疫苗。     

西伯利亚鲟致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定

为分离鉴定引起四川省绵阳市水箱养殖的西伯利亚鲟患病及死亡的病原菌,本研究从患病西伯利亚鲟脾脏组织分离纯化得到一株病原菌,命名为XYCY-1。对其进行了形态特征、理化特性等生物学表型检验、感染回归试验、16S rRNA基因进化分析、病理观察及药敏试验。结果显示,该菌属于嗜水气单胞菌;人工感染试验显示该分离菌对西伯利亚鲟鱼具有致病性,实验鱼发病和死亡症状与自然发病鱼基本相同。表明嗜水气单胞菌是此次鲟鱼发病的病原;分离菌株对头孢西丁、卡那霉素、庆大霉素、强力霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、新霉素7种药物敏感,对氨苄青霉素、四环素、洛美沙星等13种药物耐药。本研究对四川绵阳地区鲟鱼发病流行的病因作出了准确诊断,为该地区鱼病预防和合理用药提供了依据。     

嗜水气单胞菌亚单位疫苗的研制

首先提纯嗜水气单胞菌Ｊ－１株的外毒素一ＨＥＣ毒素和脂多糖，进而将脂多糖脱去类脂Ａ，再用ＥＤＣ法将ＨＥＣ毒素与多糖偶联。偶联物经双抗体夹心ＥＬＩＳＡ和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００层析鉴定确认，ＨＥＣ毒素与多糖的偶联比为１：１．３。偶联物作为亚单位苗，对小鼠和鲫鱼均无毒性，能诱导免疫小鼠和鲫鱼产生坚强的保护，对同源菌株的攻击保护率，小鼠１００％，鲫鱼８３％。与嗜水气单胞菌的全菌苗和毒素苗相比，亚单位苗诱导的抗体出现早，滴度高，持续时间长。     

长春市售乌鳢携带嗜水气单胞菌情况调查

为探讨乌鳢体内嗜水气单胞菌携带情况,本调查以长春市售表观健康乌鳢为研究材料,从其体内分离并鉴定嗜水气单胞菌,并对分离株携带毒力基因情况进行调查,同时选取代表株进行致病性试验。结果显示:共分离嗜水气单胞菌107株,其中56%以上分离株携带3种以上毒力基因,88.79%(95/107)的分离株携带Lux S基因;致病性试验结果显示,携带毒力基因菌株对小鼠、斑马鱼均有一定致病性,随着菌株携带毒力基因种类的增多,致病力也相应增强。研究结果对研发食用乌鳢的公共卫生安全具有一定意义。     

用点酶法检测鱼类致病性嗜水气单胞菌HEC毒素

本试验建立的检测嗜水气单胞菌HEC毒素的点酶法,可在嗜水气单胞菌培养上清和临床病料中检出HEC毒素,可检出的最低水平为95ng/ml。用该法检测大肠杆菌、沙门氏菌、鳗弧菌、荧光假单胞菌、温和气单胞菌等的培养上清及患草鱼出血病的病鱼病料,均为阴性反应,仅与豚鼠气单胞菌、杀鲑气单胞菌新亚种及吕克氏耶尔森氏菌有轻度的交叉反应。对72株病鱼分离菌及33份病鱼组织的检测结果表明,点酶法与溶血试验的符合率分别为80.7%和90.9%。以上试验重复3次,结果完全一致。综上可见,用点酶法检测嗜水气单胞菌HEC毒素,无须作复杂的细菌鉴定,并能直接用于病料,是一个快速、敏感、特异、有效的方法,显示出广阔的应用前景。     

致病性嗜水气单胞菌耐喹诺酮类药物菌株的分离鉴定

对吉林省内12个水域采集和送检的66尾病鱼进行了细菌分离鉴定，共检出46株嗜水气单胞菌疑似菌，通过生化试验结合PCR扩增气溶素基因Aer，确定其中22株为致病性嗜水气单胞菌。进一步采用纸片扩散法和双倍稀释法测定嗜水气单胞菌分离株对多种抗生素的耐药性，其中有4株对喹诺酮类药物耐药，并且为交叉耐药，耐药菌检出率为18．2％，纸片扩散法检测其对喹诺酮类药物的抑菌圈均小于19mm。将病料中分离的8株嗜水气单胞菌负染后电镜观察，耐药菌表面有许多大小不同的球形结构，而敏感菌表面则为细丝状菌毛结构。     

鸡大肠杆菌蜂胶灭活菌苗的制作方法及注意事项

选本地分离的禽致病性大肠菌菌株若干株加标准菌株,用LB培养基培养细菌。甲醛灭活后,制成鸡大肠杆菌蜂胶灭活菌苗。经试验,该蜂胶灭活菌苗安全且免疫效力好。     

鸭源致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定与生物学特性分析

为了解嗜水气单胞菌的肉鸭健康带毒、致病与耐药情况,对贵州省三穗县某肉鸭屠宰场临床健康肉鸭随机取样,进行嗜水气单胞菌的分离鉴定、毒力基因检测及耐药性分析。结果显示,分离菌具有嗜水气单胞菌典型的培养特征,菌落形态、菌体形态和生化特性均与嗜水气单胞菌相符;16 S rRNA基因序列系统进化树显示,该分离菌与嗜水气单胞菌聚为一支,同源性均>99%;动物回归试验显示,该分离菌对小鼠有较强的致病性;毒力基因PCR检测显示,该分离菌携带aer、hly、epa、act、alt和ahp等6种毒力基因;药敏试验结果显示,该分离菌对复方新诺明、磺胺嘧啶、环丙沙星和诺氟沙星等15种药物耐药;耐药基因PCR检测显示,该分离菌携带qnrB、Sul1和IntI1等3种耐药基因,与药敏试验表型相符。研究结果为嗜水气单胞菌的生物学特性研究及防控提供参考依据。     

嗜水气单胞菌苗预防白鲫暴发性传染病的田间试验

本文对田间大规模使用嗜水气单胞菌苗预防淡水鱼暴发性传染病进行了初步研究。选取患病死亡最为严重的白鲫为对象,采用腹腔注射和浸泡两种免疫方法,对精养鱼池放养的1万3千余尾白鲫进行免疫接种,所用疫苗为自行研制的嗜水气单胞菌苗。结果表明:在暴发性传染病自然流行的情况下,免疫接种组的发病死亡率为10.8%,未免疫接种的平行对照组发病死亡率为16.4%,两者间的差异极显著(P<0.01);在免疫接种组中,浸泡免疫组的发病死亡率为10.4%,腹腔注射免疫组的发病死亡率为11%。两者间的差异不显著(P>0.05),由此可见,应用嗜水气单胞菌苗进行免疫接种,可有效地预防淡水鱼的暴发性传染病。浸泡免疫的成功为该苗的进一步推广展示了广阔的前景。     

瑶山亚种树鼩源嗜水性气单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究

为确诊广西中医药大学瑶山亚种树鼩人工驯化养殖中心的瑶山亚种树鼩发病死亡原因,并调查分离菌株的致病性与耐药情况,试验通过平板划线分离获得病原菌,进一步对分离菌进行形态观察、培养特性、生化试验及16S rRNA序列分析,纯化获得一株致病性嗜水性气单胞菌;利用昆明小鼠的致病性试验测定了该分离菌株的半数致死量（LD₅₀）,利用药敏纸片法分析该分离株对常用药物的敏感性,并应用PCR方法进行菌株耐药基因的检测。结果显示,从病死瑶山亚种树鼩分离到一株嗜水性气单胞菌,镜检显示为革兰氏阴性菌,形态呈短杆状。该菌16S rRNA序列与日本淡水湖源嗜水性气单胞菌SWCY-3.27株同源性高达100%,遗传进化关系最近。该分离菌对成年昆明小鼠的LD₅₀为1×10⁷ CFU,毒力高于模式菌株ATCC 7966,近似于中国流行株NJ-35和J-1等,致病性试验鉴定该菌为强毒力菌株。生化鉴定七叶苷、阿拉伯糖、氧化酶呈阳性,各种生化鉴定符合嗜水气单胞菌生化特性。药敏检测显示,该菌株对米诺环素、链霉素、妥布霉素等9种药物敏感,对四环素、红霉素、青霉素等10种药物耐药。以PCR扩增基因方法对分离菌进行6类12种耐药基因的检测,发现分离菌存在氨基糖苷类（Aph-（3）-lia）和β-内酰胺类（mecA）两类抗生素的耐药基因,与药敏试验结果基本吻合。本研究结果表明,引起此次树鼩死亡的病原菌为嗜水性气单胞菌,可用高敏药物进行针对性治疗,为防治嗜水性气单胞菌感染导致的树鼩疾病提供参考依据。     

瑶山亚种树鼩源嗜水性气单胞菌的分离鉴定及生物学特性研究

为确诊广西中医药大学瑶山亚种树鼩人工驯化养殖中心的瑶山亚种树鼩发病死亡原因,并调查分离菌株的致病性与耐药情况,试验通过平板划线分离获得病原菌,进一步对分离菌进行形态观察、培养特性、生化试验及16S rRNA序列分析,纯化获得一株致病性嗜水性气单胞菌;利用昆明小鼠的致病性试验测定了该分离菌株的半数致死量(LD_(50)),利用药敏纸片法分析该分离株对常用药物的敏感性,并应用PCR方法进行菌株耐药基因的检测。结果显示,从病死瑶山亚种树鼩分离到一株嗜水性气单胞菌,镜检显示为革兰氏阴性菌,形态呈短杆状。该菌16S rRNA序列与日本淡水湖源嗜水性气单胞菌SWCY-3.27株同源性高达100%,遗传进化关系最近。该分离菌对成年昆明小鼠的LD_(50)为1×10~7 CFU,毒力高于模式菌株ATCC 7966,近似于中国流行株NJ-35和J-1等,致病性试验鉴定该菌为强毒力菌株。生化鉴定七叶苷、阿拉伯糖、氧化酶呈阳性,各种生化鉴定符合嗜水气单胞菌生化特性。药敏检测显示,该菌株对米诺环素、链霉素、妥布霉素等9种药物敏感,对四环素、红霉素、青霉素等10种药物耐药。以PCR扩增基因方法对分离菌进行6类12种耐药基因的检测,发现分离菌存在氨基糖苷类(Aph-(3)-lia)和β-内酰胺类(mecA)两类抗生素的耐药基因,与药敏试验结果基本吻合。本研究结果表明,引起此次树鼩死亡的病原菌为嗜水性气单胞菌,可用高敏药物进行针对性治疗,为防治嗜水性气单胞菌感染导致的树鼩疾病提供参考依据。     

集约化猪场发生猪链球菌病的调查与防制

1994-1996年，在几个不同规模的集约化猪场暴发了猪链球菌病，造成严重的经济损失，从流行病学调查、临床诊断及剖检变化等一些方面观察，该病发生了某些新的变化，从分离到的致病性不贩 菌株检验，它们在溶血性，生化特性、药敏试验及对试验及对试验动物的致病力等方面也有一定差别。用当地分离菌株制成多价灭活菌苗，免疫保护护力良，结合综合防制（治）措施，有效地控制了该病的发生。     

6株嗜水气单胞菌的毒力因子及其对小鼠的致死性

根据嗜水气单胞菌毒素、蛋白酶及Ｓ蛋白３种毒力因子的检测结果,从６６株嗜水气单胞菌中选出３种毒力因子分布情况各异的有代表性的６个菌株。分别用含菌量均为１０８ＣＦＵ／ｍＬ的６株嗜水气单胞菌肉汤培养物注射小鼠,结果,毒素、蛋白酶及Ｓ蛋白均有的菌株以及具有前两者而无Ｓ蛋白的菌株对小鼠的致死率均达１００％;仅有蛋白酶的菌株对小鼠致死率达６０％;而只有Ｓ蛋白的,或既有毒素又有Ｓ蛋白的,或３种毒力因子均无的菌株对小鼠无致死性。     

某池塘鱼细菌感染的暴发调查

辽宁省大连市某人工池塘养殖的淡水鱼苗出现大量死亡。从病死鱼体内分离到一株致病性嗜水气单胞菌和一株类志贺邻单胞菌。对鱼饲料、池塘环境样品进行细菌计数与优势菌筛查,发现池底淤积物和池塘排水管污物中细菌总数严重超出限值,优势菌为致病性嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌和摩氏摩根菌,与病死鱼体内分离到的细菌基本一致。由此判断引起池塘鱼感染的细菌主要来源于池底淤积物和池塘排水管污物。