碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析

从碱茅酵母cDNA文库中经过NaCl、NaHCO₃筛选,均得到长为1153 bp碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因(PutTPS)片段。通过3'End cDNA amplification方法获得基因缺失的3'序列,该基因全长3358 bp,编码882个氨基酸。氨基酸序列比较结果表明,PutTPS氨基酸序列与水稻、拟南芥、玉米等多种高等植物的TPS蛋白的同源性高达60%90%。利用Northern blot技术,研究该基因的组织表达模式及NaCl、NaHCO₃胁迫处理下基因的表达模式变化;同时对转pYES₂- PutTPS基因酵母菌株进行盐、碱、氧化胁迫、渗透胁迫处理,观察其在逆境下的生存表现。结果表明,PutTPS具有组织表达特异性,其中在根和花中表达量最大;NaCl、NaHCO₃会诱导PutTPS 基因在根和叶中的上调表达;同时重组酵母菌株对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力显著增强。以上研究结果表明,碱茅PutTPS基因与逆境之间具有一定的应答关系,并在植物适应环境逆境过程中起着重要的作用。     

鸡膜联蛋白A2的原核表达与纯化

试验旨在对鸡膜联蛋白A2(ANXA2)基因进行原核表达与纯化。利用鸡ANXA2基因特异性引物从鸡卵泡细胞cDNA中扩增ANXA2基因,亚克隆至原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并分析重组蛋白的表达形式;利用含Ni2+琼脂球对重组蛋白进行纯化,并利用Western blot进行鉴定。结果显示:成功构建重组原核表达载体pET-32a-chANXA2,重组蛋白His-chANXA2在0.1 mmol/L IPTG、诱导表达5 h和30℃诱导温度条件下表达量高,其在上清和包涵体中均有表达,但主要以包涵体形式存在。利用含Ni2+琼脂球从诱导菌裂解物上清中得到了纯度较高的重组蛋白,Western blot检测到与预期大小相符的重组蛋白条带。研究结果为后续开展ANXA2调控鸡卵泡发育的分子机制研究奠定基础。     

鸡IL-18 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用RT—PCR方法，从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系MIDCC-MSBI总RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18，ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明，克隆得到的ChIL-18cDNA与国外报道的完全一致，包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp，编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL-18成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，构建成原核表达质粒pGEX—ChIL18。该质粒的BL21(DE3)DysS转化菌在IPTG的诱导下可高效表达GST—ChIL18基因融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的32％。     

蒺藜苜蓿E3泛素连接酶U-box基因克隆及表达分析

泛素化在植物生长和发育过程中起重要作用,E3泛素连接酶负责对靶蛋白特异性识别,其中U-box结构的E3泛素连接酶具有调控植物生长发育和免疫反应等功能,并在抗逆性方面发挥作用。目前,关于蒺藜苜蓿U-box家族基因的研究尚未见报道。本研究从蒺藜苜蓿中克隆得到U-box(MtPUB4)基因,该基因cDNA全长2448bp,编码815个氨基酸,包括1个U-box结构(C-X2-H-X7-C-X7-C-X2-C-H-X2-H)和5个ARM结构域,属于U-box/ARM类型E3泛素连接酶。构建原核表达载体pET-MtPUB4,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明在大肠杆菌中表达了MtPUB4蛋白。荧光定量PCR分析表明MtPUB4基因在蒺藜苜蓿花中的表达量最高,在根中表达量最低。MtPUB4基因受到NaCl、聚乙二醇、脱落酸诱导,随着诱导时间增加,表达量呈现出增长趋势。这些结果表明,MtPUB4基因在蒺藜苜蓿生长发育和抗逆性中可能起到重要调节作用,但在低温胁迫中表达量稍微下降,变化不明显。本研究成功构建了pBI121-MtPUB4植物表达载体,为进一步转化拟南芥突变体Atpub4奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美尔球虫HAP2基因的克隆与原核表达

为研究鸡柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)HAP2(hapless2/generative cell-specific)蛋白的抗原性,根据Gen?Bank发表的HAP2基因的cDNA序列(Gene ID:25252561)ORF设计1对引物,用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫配子体总RNA中扩增HAP2基因,将扩增产物与pMD18-T载体连接后进行测序和序列分析,将测序正确的HAP2基因亚克隆入原核表达载体pET32a,转化宿主菌E.coli RGB,在IPTG诱导下进行原核表达。结果在20℃诱导12 h条件下成功表达了HAP2融合蛋白大小为41 ku,并应用磁珠纯化的方法纯化了重组蛋白,获得了HAP2融合蛋白,为进一步研究HAP2的抗原性奠定基础。     

羊草液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白基因LcNHX1的克隆及功能分析

植物Na~+/H~+逆向转运蛋白具有调节pH值和维持细胞内Na~+平衡、减少盐胁迫对植物伤害的功能。本研究从羊草中克隆Na~+/H~+逆向转运蛋白基因LcNHX1,并对它的功能进行了初步分析。该基因全长2022bp,其中ORF区1614bp,编码537个氨基酸。LcNHX1蛋白具有10个跨膜区,且具有NHX蛋白的多个典型结构特征。半定量RT-PCR结果表明,盐(NaCl 400mM)、碱(NaHCO_3150mM)、盐碱(NaCl 200mM+NaHCO_3100mM)、干旱(10%PEG8000)、低温(4℃)和ABA(100μM)均能够不同程度的诱导LcNHX1基因的表达。利用Δnhx1盐敏感酵母突变体进行功能互补试验,结果发现在60mM、100mM NaCl胁迫条件下,转基因酵母Δnhx1+LcNHX1不仅回补了酵母突变株Δnhx1的盐敏感特性,并且具有更高的耐盐能力。通过比较转LcNHX1基因株系与野生型拟南芥幼苗在含有50mM NaCl和8mM NaHCO_3的MS培养基中的生长情况,发现转基因拟南芥株系具有更好的抗盐碱能力。     

草地早熟禾NAC基因鉴定及非生物胁迫下表达模式分析

草地早熟禾(Poa pratensis)是世界上广泛应用的草坪草种,其抗逆基因的挖掘对抗逆新品种的选育具有重要意义.NAC基因家族是植物特有的转录因子之一,在植物逆境响应中起到重要作用.以二穗短柄草(Brach ypodium distach yon)的NAC蛋白序列为请求序列,从草地早熟禾转录组数据库序列比对分析得到15个草地早熟禾PpNACs基因的cDNA全长序列,具有完整的开放阅读框.运用生物信息学方法预测早熟禾NAC家族成员的理化性质和保守结构域,发现15个PpNACs转录因子都是酸性蛋白,除PpNAC16外都属于不稳定蛋白,疏水性蛋白,具有相似的结构,通过聚类分析可将15个PpNACs成员分为3类.荧光定量PCR结果显示,在重金属胁迫下显著上调表达的基因有Pp-NAC10、PpNAC18、PpNAC19和PpNAC24,在盐胁迫过程下显著上调表达的基因有PpNAC10和PpNAC24,在干旱胁迫下显著上调表达的基因有PpNAC1、PpNAC6、PpNAC10和PpNAC13,在低温胁迫下显著上调表达的基因有PpNAC1、PpNAC10和PpNAC18,在高温胁迫下显著上调表达的基因有PpNAC20.其中,PpNAC10在重金属、盐、干旱和低温胁迫下均被显著诱导上调表达,Pp-NAC18在重金属、干旱和低温胁迫下均被显著诱导上调表达,PpNAC10和PpNAC18可作为草地早熟禾逆境胁迫响应的候选基因.     

洛阳土种鸡IL-2 cDNA的克隆及原核表达

应用RT-PCR技术从新城疫I系疫苗诱导的洛阳土种鸡胚脾淋巴细胞中扩增到全长0.43kb的鸡IL-2基因cDNA,将IL-2cDNA克隆到PMD-T载体,测序结果表明,该基因为不含终止密码子的目的基因。将该目的基因克隆到原核表达载体PET-28a,获得的重组质粒PET-28a-IL2经酶切、PCR及序列测定,表明IL-2基因插入的位点、大小与读码框均正确。PE-28a-IL2在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在14ku处出现一条约占总蛋白21％的蛋白带,表明所克隆的IL2基因在大肠杆菌中得到良好的表达,为进一步研究IL-2的生物学特性奠定了基础。     

鸡Mx基因的克隆与原核表达

本研究旨在通过克隆鸡Mx全基因序列进而进行该基因的原核表达,获得具有生物学活性的蛋白.利用poly Ⅰ:C诱导鸡胚成纤维细胞Mx基因表达,克隆了Mx基因全长cDNA序列,将开放阅读框(ORF)连接构建于表达质粒pGEX-4t-2中获得重组表达载体pGEX-Mx,转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导后检测.表达产物检测显示该蛋白的相对分子量为75 ku.说明获得了Mx基因的高效表达,为进一步进行Mx基因的活性检测以及利用Mx蛋白进行抗病毒转基因的研究奠定了基础.     

紫花苜蓿MsWRKY33转录因子的分离及遗传转化研究

WRKY转录因子是植物特有的转录因子,广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。但是对紫花苜蓿中WRKY转录因子的研究还较少。本研究从紫花苜蓿中克隆了一个WRKY I类转录因子MsWRKY33。该基因CDS全长1536 bp,编码512个氨基酸,结构分析显示MsWRKY33包括两个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构(C-X4-C-X23-H-X-H),表明其属于WRKY I 族WRKY转录因子。亚细胞定位预测MsWRKY33蛋白定位在细胞核。MsWRKY33基因受盐、干旱和冷胁迫诱导,暗示基因可能参与了这些逆境胁迫的调控。构建原核表达载体pET-MsWRKY33, SDS-PAGE分析表明在大肠杆菌中表达了MsWRKY33蛋白。扩增MsWRKY33编码区cDNA,以pBI121为基础载体,构建植物超表达载体pBI121-MsWRKY33。采用农杆菌介导的愈伤组织培养法转化紫花苜蓿。利用nptⅡ基因引物和载体特异引物检测抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入紫花苜蓿基因组中。qRT-PCR检测发现,MsWRKY33基因在转基因株系中得到增强表达。本研究为进一步探索WRKY转录因子基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

纤维素酶基因克隆与表达

纤维素酶应用广泛,但因受到酶活低、成本高等诸多因素的制约,纤维素酶的工业化生产和应用受到限制.应用基因工程技术来获得高活性、高产量的纤维素酶资源越来越受到人们的重视.本文对纤维素酶分子结构、基因的克隆、原核与真核表达进展进行了综述,并提出构建纤维素酶酵母表达系统、木霉表达系统以及多个纤维素酶基因共表达系统是未来纤维素酶基因工程的发展趋势.     

外源基因在减毒沙门氏菌载体中的遗传稳定性和表达

减毒沙门氏菌接种机体后,能够诱导自身及所携带的外源基因免疫,是具有前景的重组疫苗。文章简要介绍了减毒沙门氏菌菌株及外源抗原基因表达产物的免疫应答,重点讨论了提高外源基因在沙门氏菌中的稳定性和表达量这两方面问题。     

兔干扰素研究进展

干扰素因其抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫活性及免疫调节作用被广泛关注和研究.兔干扰素的研究与其他动物干扰素的研究相比较为落后.文章综述了兔干扰素的分类、原核表达、真核表达、抗病毒活性的研究进展,并结合兔干扰素的相关研究进展进行了展望.     

The Expression Characteristics of MYNN Gene in Different Tissues and Muscles of Pig

This study was aimed to investigate the expression characteristics of myoneurin (MYNN) gene in different tissues and its developmental expression in muscles (longissimus dorsi, biceps femoris and psoas major), cerebellum, liver, pancreas, kidney, stomach, spleen and lung tissues of pigs. The expression characteristics of MYNN mRNA in 11 different tissues including heart, liver, spleen, lung, kidney, cerebellum, small intestine, pancreas, stomach, biceps femoris and fat of Large White pigs and Mashen pigs at the age of 90 days and the developmental expression patterns in muscle, cerebellum, liver, pancreas, kidney, stomach, spleen at three strages (1, 90, 180 days) of Large White pigs and Mashen pigs were studied by Real-time PCR. The results showed that MYNN was widely expressed in various tissues of pigs, and there was significant difference among the tissues(P < 0.05; P < 0.01); The expression of MYNN in muscle, liver, pancreas, cerebellum, kidney, stomach, spleen, lung tissues were significant difference at three development stages of Large White pigs and Mashen pigs(P < 0.05; P < 0.01), and also had a specific rule, which indicated that it may play an important role in these pig tissues. The expression of MYNN gene could related to the tissue, age and the genetic background of breeds. The results of this study provided a better understanding of the biological functions of pig MYNN. Further studies are required to determine its molecular mechanisms, especially in the regulation of skeletal muscle development.     

MYNN基因在猪不同组织及肌肉中的表达规律

试验旨在研究myoneurin（MYNN）基因在猪不同组织中的表达特征及其在肌肉（背最长肌、股二头肌和腰大肌）、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR技术研究猪MYNN mRNA在90日龄大白猪和马身猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小脑、小肠、胰脏、胃、股二头肌及脂肪共11个组织中的表达谱,以及在大白猪和马身猪1、90、180日龄3个发育阶段的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。结果表明,MYNN在猪的各种组织中广泛表达,且各组织间表达差异显著或极显著（P < 0.05;P < 0.01）;MYNN在大白猪和马身猪的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的不同发育阶段表达差异显著或极显著（P < 0.05;P < 0.01）,并具有特定规律,由此推测其可能在猪的这几种组织中发挥重要作用。MYNN基因的表达与组织、日龄及品种的遗传背景有关。本试验为研究猪MYNN基因的生物学功能提供了依据,但还需要深入的研究来探索其作用的具体机制,尤其是在骨骼肌发育中的调节机制。     

PRRSV GP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。     

外源基因在甲醇酵母Pichia pastoris中的表达策略

甲醇酵母Pichia pastoris表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，在其乙醇氧化酶基因启动子的控制下，某些外源基因的表达量可达克／升以上。虽然该系统是一种优良的表达系统，但有许多因素影响外源基因在其中的表达，包括外源基因的拷贝数及其整合到酵母染色体的位置和方式、mRNA的5′和3′端非翻译区、转录起始密码子的上下文、外源基因A＋T的组成与转录和翻译的阻断、密码子的偏爱性、信号肽序列的特性、产物的稳定性、宿主菌的生理特性、培养基成份和培养条件等。在应用该表达系统过程中，这些因素均需予以考虑。本文就这些因素作了概述和讨论，有利于提高外源基因在该系统中的表达水平。     

抗菌肽基因工程表达技术研究进展

抗菌肽是生物体用来抵御外来病原体入侵而产生的具有抗菌作用的一类小分子蛋白质,是很多生物先天非特异性防御系统的重要组成部分,具有抗生素无可比拟的优点,是当前最为理想的抗生素替代品。实践表明,基因工程抗菌肽表达技术是大量获得抗菌肽最为经济、科学的有效途径。抗菌肽的表达目前主要以大肠杆菌和酵母表达系统为主,针对近年来抗菌肽开发的策略和实践,作者对大肠杆菌表达系统和酵母表达系统进行了简要综述,以期为抗菌肽的应用和推广提供参考。     

大肠杆菌植酸酶appA2基因真核表达载体的构建及在细胞中的表达

根据已经公布的植酸酶appA2基因序列,设计合成了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从大肠杆菌中扩增得到植酸酶appA2基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组真核表达质粒pcDNA-appA2,对重组表达质粒鉴定正确后,转染猪PK15细胞,经G418筛选后,通过实时荧光定量PCR检测细胞内appA2表达,同时测定细胞内植酸酶的活性,检测结果表明,本试验成功构建了pcDNA-appA2重组真核表达载体,转染细胞后appA2的表达量是对照组的1 686.55倍,同时具有较好的植酸酶活性,为通过生物反应器制备植酸酶研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.