白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析

白颖苔草(Carex rigescens(Franch.)V.Krecz.)的热激转录因子基因是重要的耐热候选基因。通过序列多重比对设计简并引物,扩增出白颖苔草的热击转录因子基因cDNA的中间片断,并在此基础上利用RACE技术得到3′端cDNA片段和5′端cDNA片段。结果表明:通过序列拼接获得该基因的全长cDNA(1226bp),命名为CrHSF。序列分析表明其含有一个完整的开放阅读框(103～1023bp),编码蛋白质含有306个氨基酸,分子量为38.75kDa,等电点为5.85。CrHSF的氨基酸序列与OsHSF的同源性为59%,与已知的其他热激转录因子也具有较高的同源性。在CrHSF的氨基酸序列中没有预测到信号肽以及跨膜区域,但是具有多种翻译后修饰的加工位点。     

鸡β-防御素Gal-1 cDNA的克隆及序列分析

利用细胞总RNA提取试剂盒,从1月龄SPF鸡白细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-1)cDNA片段。PCR产物经凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接,转化感受态JM109细胞,在含X-gal、IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与质粒限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段ORF大小为198bp,用Blast程序进行检索比较表明该序列与Genbank中发表的鸡Gal-1 cDNA编码区序列同源性高达99.5%。该cDNA序列编码65个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由40个氨基酸残基组成。     

鹅DHRS7基因克隆、序列分析及其在鹅肥肝形成过程中的表达特点

为获得鹅DHRS7基因全长cDNA,并探讨该基因是否参与鹅肥肝的形成过程。本研究应用抑制消减杂交文库获得鹅DHRS7基因部分EST序列,采用RACE技术扩增了鹅该基因全长cDNA,并对其序列进行了生物信息分析;用荧光定量PCR技术检测了DHRS7在鹅肝脏、皮脂、腹脂等10个组织中的差异表达,以及填饲对鹅肝脏中DHRS7表达变化的影响。结果发现,鹅DHRS7基因cDNA全长1 279bp,含一个完整的开放阅读框1 011bp(可编码336个氨基酸),25bp的5′UTR和243bp的3′UTR序列;生物信息学分析结果显示,鹅DHRS7含有跨膜结构域以及NADP结合位点,且在这些功能区域变异较少;荧光定量结果显示,DHRS7在鹅肝脏和脂肪组织中都有较高表达,填饲后鹅肝脏中DHRS7的表达水平显著上调(P<0.05)。以上结果表明,DHRS7在鹅肥肝形成过程中具有重要的作用。     

从江香猪抑制素α基因克隆及其卵巢表达研究

为了探索抑制素α基因(inhibin-α,INHA)与从江香猪繁殖性状之间的相关性,试验采用特异性聚合酶链式反应(PCR)技术克隆从江香猪INHA基因,测定其核苷酸序列,通过等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)方法检测从江香猪低产群与高产群之间INHA基因的多态性变化,以实时荧光定量PCR技术检测高产、低产从江香猪卵巢组织中INHA基因的表达量。结果表明,从从江香猪基因组中成功克隆了INHA基因,编码区完整,全长1095 bp,编码364个氨基酸;经比对发现, INHA基因外显子2序列中存在2个候选SNPs位点(G359A和A373G)。经大样本检测,从江香猪高产群与低产群之间2个候选SNPs位点的基因频率没有明显差异;相比之下,高产从江香猪卵巢中INHA基因的表达量较高。研究结果提示,从江香猪INHA基因结构保守,可能主要通过基因的表达量变化调节从江香猪卵巢的生长和卵泡的发育。     

桑树花青素合成酶(ANS)基因的克隆及在2种果色桑树中的表达特征

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是植物花青素生物合成途径末端的关键酶,催化无色花色素到有色花色素的转变。从广东桑品种粤椹大10中克隆得到一条ANS序列,其ORF为1 077 bp,编码358个氨基酸,预测蛋白质分子质量为41 kD,等电点为5.62,具有2-酮戊二酸双加氧酶的保守结构域。多重序列比对表明物种间的ANS序列高度保守,系统进化树中桑树ANS与芍药科、芸香科、葡萄科等植物的同源序列聚在一个类群上。RT-PCR检测桑树ANS在结紫色果的粤椹大10的幼叶和桑椹中特异性表达,并且随着果色加深其表达水平呈上升趋势,而在结白色果的桑品种珍珠白的幼叶和桑椹中检测不到ANS的表达,暗示桑树ANS在桑椹的颜色形成中起到重要作用。     

滩羊β-防御素基因的克隆和表达

选取滩羊β-防御素分布较多的气管、食道和口腔等部位的黏膜组织,提取组织总RNA,RT-PCR获得滩羊β-防御素基因全序列.构建逆转录病毒表达载体,实现滩羊β-防御素基因的表达.经测序后得到滩羊β-防御素编码区的核苷酸序列(64个氨基酸).成功构建了带有滩羊β-防御素基因的逆转录病毒载体pLEGFP-SBD,在蓝光激发光下能观察到绿色荧光蛋白,并用SDS-PAGE方法检测到分子量约为8 kD的目的蛋白.该蛋白具有抗细菌和抑制VSV病毒增殖的活性.     

奶水牛固醇携带蛋白2基因克隆、生物信息学分析及其组织表达检测

本研究旨在对水牛固醇携带蛋白2（sterol carrier protein 2,SCP2）基因进行克隆及生物信息学分析,并检测其在水牛不同组织中的表达。以黄牛SCP2基因（登录号：NM_001033990.3）为种子序列成功克隆了水牛SCP2基因完整CDS区,该序列长1 632 bp,可编码543个氨基酸;其与黄牛、绵羊、山羊、白鲸、人、家犬和家猫的同源性分别为95.9%、93.4%、92.4%、89.4%、88.3%、86.3%和86.9%,说明SCP2基因CDS区在不同物种间具有较高的保守性。聚类分析则表明水牛与黄牛的分子进化关系最近;氨基酸序列分析表明,SCP2蛋白的分子式为C₂₆₀₂H₄₁₃₁N₇₀₉O₇₇₄S₂₉₈,分子质量为58.66 ku,理论等电点（pI）为8.59,不稳定系数为27.94,平均亲水性为-0.215,属于碱性、稳定、亲水蛋白质;二级结构分析表明水牛SCP2蛋白由α-螺旋、无规则卷曲和延伸链构成,其中α-螺旋占35.54%,无规则卷曲占48.99%,延伸链占15.47%,与三级结构预测结果一致;亚细胞定位分析表明,水牛SCP2蛋白分布在细胞质（43.5%）、过氧化物酶体（21.7%）、线粒体（17.4%）、细胞核（13.0%）和细胞骨架（4.4%）;跨膜结构和信号肽预测分析表明,水牛SCP2蛋白不含跨膜结构和信号肽;磷酸化位点分析发现,水牛SCP2蛋白有13个Ser、3个Thr和2个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化位点;蛋白质结合位点预测结果显示,水牛SCP2蛋白含有12个蛋白质结合位点和1个多核苷酸结合位点;实时荧光定量PCR结果表明,水牛SCP2基因在肝脏中表达量最高,其他组织中表达量从高到低依次为乳腺、淋巴、肾脏、大肠、胃、肺脏、脾脏、卵巢、垂体、大脑和心脏。本试验为今后进一步探讨SCP2基因的功能奠定了基础。     

金草鱼Serpinc1基因克隆及其序列分析

获取金草鱼Serpinc1基因序列,研究金草鱼与草鱼Serpinc1基因的差异,并预测金草鱼Serpinc1基因序列的特征及其编码蛋白的高级结构。本研究利用RT-PCR克隆测序技术获得金草鱼Serpinc1基因序列,分析其与草鱼Serpinc1基因的差异,并通过生物信息学方法预测金草鱼Serpinc1基因序列的特征及其编码蛋白的高级结构。结果显示,金草鱼Serpinc1基因与草鱼相比共有4个核苷酸位点发生改变(c.1091TA、c.1116AT、c.1176TG和c.1179CT),其中仅有1个位点(c.1091TA)为错义突变,导致第364位缬氨酸(Val)转变为谷氨酸(Glu)。生物信息学预测结果表明,金草鱼Serpinc1基因开放阅读框长度为1 353 bp,共编码450个氨基酸,分子量为50.89 kDa,理论等电点为6.58,不稳定指数为34.55,属于不稳定蛋白;编码氨基酸包含20种标准氨基酸,其中亮氨酸最多(10.2%),而色氨酸(Trp)含量最少(1.3%);整条肽链的亲疏水平均值为-0.213,表现为亲水性;包含4个糖基化位点和37个磷酸化位点;蛋白质二、三级结构以α结构和功能及其发挥该功能的活性位点的验证奠定了基础,为金草鱼出血性疾病相关分子标记的筛选提供了理论基础。     

昆明犬IGF2基因克隆、生物信息学分析及其时空表达研究

【目的】 克隆昆明犬胰岛素样生长因子2（IGF2）基因并研究其序列特征及时空表达规律,为工作犬体型及生长发育相关研究提供基础资料。【方法】 采用PCR法扩增昆明犬IGF2基因CDS区,运用生物信息学分析预测昆明犬IGF2蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR技术检测IGF2基因在2.5月龄昆明犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及大腿内侧肌肉和不同年龄段肝脏中的表达情况。【结果】 昆明犬IGF2基因CDS区全长717 bp,编码238个氨基酸;系统进化树分析显示,昆明犬IGF2基因与赤狐的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析表明,IGF2蛋白分子质量为26.46 ku,理论等电点为9.61,无信号肽和跨膜结构,属于亲水性非分泌蛋白;主要分布于细胞核（47.8%）和线粒体（17.4%）,存在23个磷酸化位点;该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构与二级结构预测结果相符。组织表达谱分析显示,IGF2基因在2.5月龄昆明犬肝脏中相对表达量最高,且极显著高于肾脏、肺脏及肌肉组织（P<0.01）;仔犬期（2.5月龄）肝脏中的IGF2基因的表达量极显著高于幼犬期（6月龄）、青年期（1岁）及成年期（1.7和2.5岁）（P<0.01）。【结论】 本研究成功克隆昆明犬IGF2基因,并发现IGF2在多个组织广泛表达,在肝脏中的表达量最高,可为深入探讨昆明犬IGF2基因在生长发育中的调控机理提供参考。     

羊干扰素Tau基因克隆与序列分析

本文应用 PCR扩增技术 ,以国外已发表羊干扰素 Tau(IFN- τ)基因序列为基础设计引物 ,在国内首次从北京绵羊、南江黄羊这两种国产羊的血液中分别扩增出 IFN- τ基因 ,并将 IFN- τ基因插入 PQE- 30载体构建重组质粒 ,经 PCR鉴定及 Sph 、H ind 双酶切鉴定证实为羊 IFN- τ基因的重组质粒。重组表达质粒测序结果表明 IFN- τ(p3)基因全长 5 16 bp,编码 172个氨基酸。实验发现 ,从北京绵羊、南江黄羊扩增出来的 IFN- τ基因序列与已发表的序列相比 ,其碱基同源性分别为 96 .3%、99.0 4 % ,氨基酸同源性分别为 :92 .4 %、97.1%。     

盐生草Actin基因片段的克隆及表达

根据藜科植物的肌动蛋白（Actin）基因编码区保守序列设计一对简并引物,提取盐生草（Halogeton glomeratus）叶片的总RNA,运用RT-PCR技术扩增出Actin基因的核心序列并连接到pMD19-T载体,阳性克隆经PCR检测后进行测序。序列分析表明,盐生草Actin基因核心序列长度为598 bp,编码198个氨基酸,并在GenBank中注册,登录号为KF699314,由盐生草Actin基因推导的氨基酸序列与其他几种耐盐植物的同源性均在94%以上,具有高度的保守性。采用荧光定量RT-PCR技术分析其Actin基因在盐生草不同器官的表达情况,结果显示其表达量恒定无差异,表明克隆的Actin基因可作为盐生草内参基因来研究其相关耐盐基因的表达。     

金荞麦查尔酮合成酶基因CHS的克隆及序列分析

采用同源克隆的方法获得金荞麦查尔酮合成酶基因(CHS)的保守片段554 bp,进一步采用染色体步移法(genome-walking)和RT-PCR技术克隆到CHS基因的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析结果表明,金荞麦CHS基因DNA全长1 650 bp,含一个462 bp的内含子;其cDNA编码区全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FdCHS,NCBI登录号为GU169470.该氨基酸序列与同为蓼科的掌叶大黄、虎杖CHS的氨基酸序列同源率分别达到94%和93%,且含有CHS活性位点和底物结合口袋位点等保守位点.     

马铃薯WRKY6基因的克隆、序列分析与原核表达研究

在高等植物中WRKY转录因子家族成员众多,它广泛参与植物对生物胁迫、非生物胁迫、生长发育和代谢过程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得马铃薯WRKY6基因,序列分析表明该蛋白属于WRKY家族第3组成员,锌指结构为C-X₇-C-X₂₃-H-X-C。构建系统发育树结果表明它与拟南芥WRKY70亲缘关系较近,相似性达58%。然后将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体。在培养温度18℃条件下添加0.2 mmol/L IPTG(异丙基硫代半乳糖苷),诱导培养8 h可获得高表达融合蛋白。进一步实验获得特异性和纯度非常高的纯化蛋白。本研究为进一步确定该蛋白的体外活性及生物学功能奠定了坚实基础。     

马铃薯WRKY6基因的克隆、序列分析与原核表达研究

在高等植物中WRKY转录因子家族成员众多,它广泛参与植物对生物胁迫、非生物胁迫、生长发育和代谢过程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得马铃薯WRKY6基因,序列分析表明该蛋白属于WRKY家族第3组成员,锌指结构为C-X7-C-X23-H-X-C。构建系统发育树结果表明它与拟南芥WRKY70亲缘关系较近,相似性达58%。然后将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体。在培养温度18℃条件下添加0.2 mmol/L IPTG(异丙基硫代半乳糖苷),诱导培养8 h可获得高表达融合蛋白。进一步实验获得特异性和纯度非常高的纯化蛋白。本研究为进一步确定该蛋白的体外活性及生物学功能奠定了坚实基础。     

犬源贾第虫β-贾第素基因的克隆及序列分析

为了鉴定犬源贾第虫佛山分离株的基因型,根据GenBank中登录的贾第虫β-贾第素(bg)基因序列(X85958),设计2对引物GF1/GR、GF2/GR,采用套式PCR方法从贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段;将扩增产物纯化并连接到质粒载体pMD18-T,克隆转入感受态细胞JM109,挑选阳性克隆测序,然后进行序列分析。结果显示,犬源贾第虫bg序列长为384 bp,与预期目的片段一致;分子进化树表明该犬源贾第虫分离株为蓝氏贾第虫D型。该基因型在我国为首次报道,为贾第虫的分子鉴定以及分子遗传学研究奠定了基础。     

鸽痘病毒TK基因的扩增、克隆及序列分析

根据3个鸡痘病毒株的TK基因序列,借助基因分析软件设计合成了引物H1 、H2一。对PPV地方分离弱毒株PPVR的3个型PPVD(大)、PPVZ(中)、PPVX(小)和强毒株PPVY及鸽痘病毒疫苗株VVG、鸡痘病毒疫苗株VVJ进行TK基因的PCR,均成功地扩增出预期大小的目的片段。对PCR产物用限制性内切酶NcoI进行酶切分析,结果酶切产物得到两条条带,大小分别为628 bp和732 bp,与3个已发表的TK基因分析结果一致。分别将6个禽痘病毒TK基因克隆至pGEM-T Easy载体中,重组质粒经PCR和酶切鉴定后,进行测序。结果表明,本试验获得的TK基因长1 360 bp,存在一个NcoI酶切位点,两个XbaI酶切位点。序列分析表明:PPVD和PPVX同VVG和VVJ的TK基因同源性为100％;在TK基因的编码区内PPVY有一个碱基与其它毒株不同;各毒株TK基因的侧翼都存在15 bp的正向重复序列和8 bp的倒转重复序列;PPVD、PPVX和PPVZ虽然来源于同一个毒株,但TK基因存在差异。     

双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白（PrP）基因,并克隆到pMD 18-T载体.序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同.4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽（九肽）重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸（除LT200302为23个氨基酸外）的C-端信号肽.4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%～100.0%和94.2%～100.0%.共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变.     

甘菊CBL基因的克隆与表达分析

基于已建立的甘菊ESTs文库,检索到了CBL基因4个不同的EST序列;采用RACE技术获得了它们的全长序列,并命名为ClCBL1-4。将甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)ClCBL与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CBL进行多重序列比对发现,它们都含有4个结合钙离子的EF-hand结构域,且ClCBL1在N端有一个豆蔻酰化序列(MGCXXSK/T)。采用RT-PCR技术,分析了甘菊中CBL基因的表达与不同逆境胁迫的关系,表明甘菊CBL基因的表达在冷、干旱、热、盐及ABA胁迫中可被不同程度地诱导,而在非逆境胁迫条件下,甘菊CBL基因在根、茎、叶及花等不同器官中均有表达,且表达量相对一致。这些结果说明该家族基因参与了植物非生物逆境胁迫的抵御。     

野生卵穗苔草泛素结合酶基因片段的克隆与序列分析

苔草(Carex L.)是我国极具研究开发潜力的乡土草坪草种质资源。采自内蒙古大青山的卵穗苔草(Carex duriuscula)具有较强的抗旱性和耐贫瘠力,是草坪草抗性育种的重要基因源之一。本研究从野生卵穗苔草干旱抑制性消减杂交的cDNA文库中测序获得一条长度为291 bp、编码50个氨基酸的cDNA基因片段,对该基因片段进行序列分析,确定其属于泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2s)蛋白家族,命名为Cd-UBC2。该基因生物信息学分析结果表明:氨基酸组成中不含吡咯赖氨酸(Ply)和硒半胱氨酸(Sec),这与其他物种UBC蛋白成分非常接近。二级结构预测表明该蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲组成,约占92%。从野生卵穗苔草中成功获得了泛素结合酶基因片段,为克隆野生卵穗苔草泛素结合酶基因全长及最终分离、克隆苔草抗性基因,草坪草遗传改良和新品种选育奠定了基础。