冰核活性细菌成冰的分子生物学基础及其在食品冷冻中的应用

对冰核活性细菌成冰的分子生物学基础、在食品冷冻中的应用及其安全性问题进行了综述,并对冰核活性微生物在食品冷冻中的应用前景进行了展望.     

冰核细菌Erwinia ananas 110 冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析

为获得具有高冰核活性的基因工程菌,从冰核细菌Erwinia ananas 110扩增冰核基因iceA,将其克隆到pMD19–T载体上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定并测序;阳性克隆目的片段亚克隆到表达载体pET–23a(+)上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定重组质粒;阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并经IPTG诱导表达。SDS–PAGE电泳检测表明,冰核基因iceA能够并以包涵体形式表达,相对分子质量约为180 000。冰核活性测定结果表明,重组菌BL21(DE3)pLysS/pET–ice的冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas 110在–5、–4、–3、–2 ℃下无明显差别。     

冰核细菌的研究方法

 简单回顾了冰核细菌研究的历史,根据我们多年来的研究工作经验,详细介绍了冰核细菌研究的基本方法和简单实用的试验研究经验,包括样品的采集、分离及冰核活性的测定等。     

冰核活性细菌拮抗菌株的筛选

 从多种植物根际土壤中分离到300个细菌分离物,通过含菌平板培养筛选出F015,F023,F046等近20株对冰核细菌具有较强的拮抗力,室内测定对冰核细菌病原物抑菌圈达0.8～3.0 cm. 挑选出F015,F023,F046进一步进行室内抗菌机理、菌株鉴定和室外田间小区实验。实验结果表明,菌株初步鉴定为芽孢杆菌（Bacillus spp.）和假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）。其代谢产物蛋白质粗提物对冰核细菌的生长有明显的抑制作用。室外防霜效果在19.5％～36.9％,可有效地控制霜冻害的发生与危害,具有广阔的应用前景。     

冰核活性细菌对黄粉虫幼虫耐寒性的影响

采用水浴和喂食两种接种方法,研究了冰核活性细菌(INA细菌)分别在不同接种浓度下对储粮害虫黄粉虫幼虫体内物质及耐寒性的影响。结果表明,分别用水浴法和喂食法接种不同浓度的INA细菌菌株S2和S24后,黄粉虫幼虫的耐寒性均显著降低,其体内脂肪、糖原和血糖含量也显著或极显著降低。同时,INA细菌水浴法接种的效果优于喂食法;INA细菌高浓度接种效果高于低浓度;菌株间,只有在用浓度为3×108cfu/ml水浴法接种时,菌株S24的效果优于菌株S2。说明利用INA细菌可显著提高储粮害虫黄粉虫越冬期间的死亡率。     

冰核细菌冰核基因多态性的研究

 根据冰核细菌基因中的多拷贝重复编码区设计并合成简并引物inaZI[5'-GCCGGTTATGGCAGC(T)ACGCTGACC-3'],通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增20株不同种属的INA⁺和INA^-细菌菌株.结果表明:所有供试的冰核活性菌株均获得扩增产物,而非冰核活性菌株则无扩增产物.冰核基因的扩增产物呈多态性.     

利用转座子Tn5诱变冰核细菌获得无冰核活性菌株

 以云南省冰核细菌的优势种类丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和菠萝泛菌Pantoea ananas为重组基因工程菌的受体菌,采用Tn5转座子诱变技术,以大肠杆菌Escherichia coli S17／pZJ25∶∶Tn5作为转座子诱变的供体菌,使Tn5插入并整合到冰核细菌基因组中,使冰核基因的线性连续性被破坏,失去冰核活性。大量筛选接合子,获得157株丧失冰核活性的菌株。     

冰核活性细菌的研究进展

 从冰核活性细菌与作物霜冻的关系,冰核活性细菌的分子生物学基础,防霜技术3个方面阐述了冰核活性细菌的研究进展。     

我国冰核活性细菌种类及其分布的初步研究

70年代以来,国外研究证明,在植物体上广泛存在的一些细菌种类如丁香假单胞菌(P·S)、草生欧文氏菌(E·h)和荧光假单胞菌(P·f)等,均具有诱发植物细胞水结冰的作用,这类细菌被称为冰核活性细菌(简称INA)。它们可以诱发许多植物在-2-- 5℃条件下发生霜冻害。我们的研究也证明,玉米和大豆幼苗接种INA的     

冰核细菌对棉铃虫结冰温度影响的研究

 以棉铃虫为对象，采取喷雾和喂食两种接种方法，研究了冰核细菌对昆虫的结冰温度的影响。结果表明：两种方法接种的冰核细菌均能明显提高棉铃虫的结冰温度，但不同接种方法间存在差异。喷雾接种的虫体结冰温度比对照高5.14-10.79℃,接种1天后就将结冰温度提高5.90℃，在棉铃虫化蛹后还能将结冰温度提高7.71℃。喂食接种虫体接种两天后才与对照的结冰温度之间出现明显的差异，能将结冰温度提高2.25-4.56℃,化蛹后仅能将结冰温度提高0.93℃。试验证明，冰核细菌能在昆虫体上起到异源冰核的作用，从而提高虫体的结冰温度。为探索一条利用生物冰核降低越冬害虫的过冷却能力，诱发虫体在较高温度下发生结冰，破坏细胞组织，造成虫体死亡，以此来提高越冬害虫的死亡率，压低来年虫源，减轻危害的促冻杀虫新途径提供了科学依据。     

山东省植物上冰核活性细菌种类与分布研究

从山东省25种植物上分离到60株冰核活性细菌，鉴定结果为：假单胞菌属有37株，其中非荧光假单胞菌10株，占16.7%；丁香假单胞菌11株，占18.3%；荧光假单胞菌2株，占3.3%；菜豆荚斑假单胞菌14株，占23.3%。欧文氏菌属有23株，其中菠萝欧文氏菌21株，占355；草生欧文氏菌2株，占3.3%。INA细菌的种类和分布受季节、环境、地域和植物种类等多种因素的影响，这是山东省关于冰核细菌研究的首次报道。     

桑细菌性疫病菌[Pseudomonas syringae pv.mori(Boyer and lambert)Young et al]的冰核活性研究

对不同桑园桑疫病菌(Pseudomonas syringae pv.mori(Boyer andlambert)Young et al)菌株的冰核活性测定表明,冰核活性细菌占17.8%.冰核活性菌不能利用山梨醇,但能产生硫化氢;而无冰核活性菌株则相反.     

小春作物上冰核细菌种群动态研究

 采用平板稀释分离计数法,在小春作物蚕豆、小麦和油菜生长期间,连续两年定点定期对冰核细菌种群数量动态变化进行检测。结果表明,在云南省昆明地区自然条件下,冰核细菌的数量最大密度出现在2月中旬至3月中旬,可达9.2×10⁹ CFU／g。     

诱发枇杷霜冻害的冰核细菌拮抗菌分离与筛选

[目的]筛选出具有防除枇杷INA细菌的拮抗菌.[方法]从枇杷根际土壤中分离冰核细菌拮抗菌,对其进行抑菌圈、杀菌能力、破坏冰核活性蛋白能力测定.[结果]从不同海拔地区的根际土壤中共分离得到128个菌株,其中有拮抗效果的有55株,平皿拮抗效果强的有15株,再经拮抗系数比较得到9株强拮抗菌菌株,最后筛选出l株杀菌率达98％、破坏冰核蛋白能力达100％的拮抗菌BL-36.[结论] BL-36既有杀菌效果又有破坏冰核蛋白能力,是具有较好利用前景的防除诱发枇杷霜冻害冰核细菌、减轻枇杷霜冻害的生物防治材料.     

杨树冰核活性细菌溃疡病的防治技术

以杨树冰核细菌溃疡病发生的主导因素为依据．提出了防治此病的主要途径：（１）选用抗性强的杨 树品种、品系．适地适树造林；（２）采用链霉素（ ６００ ｍｇ／ｋｇ）、水基杨酸（ １０ ｍｍｏｌ／Ｌ）、乙酸苯汞（ １００ ｍｇ／ｋｇ）和灭活的成团泛氏菌（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ＝Ｅｒｗｉｎｉａ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）等诱导剂浸泡杨树插穗进行育苗、有 明显的诱导抗病效果．平均诱导效果达７０％以上；（３）将插穗进行沙藏处理和地膜覆盖育苗可避免霜冻害和旱 害．减轻杨树冰核细菌的侵染、又能提高苗木的生长．平均提高生长率达３０％以上；（４）在早春杨树萌芽前喷 洒链霉素（ ６００ ｍｇ／ｋｇ）＋防冻保护剂（ １００ ×）对该病有一定防治效果、平均达万． ８３％。     

防除INA细菌减轻蚕豆霜冻害的研究

 用室内测定及田间试验的方法,从10种供试药剂中筛选出1号、3号、4号、5号、10号等5种防霜剂,用于防除INA细菌,减轻蚕豆霜冻,效果稳定。在此基础上开发的农大防霜剂5号,防霜效果好,能使蚕豆增产10%～20%,具有良好的应用前景。     

杨树冰核细菌溃疡病的测报技术

运用逐步回归分析方法，建立了多元线性的中期预报方程，入选的自变量有初台病情y0、年平均温度t1、温湿比x1和湿雨比x24个因子，该模型可以预测第二年的病情指数，根据病情指数随时间增长的趋势，选用灰色方法建立了GM（1、1）数学模型，模型中的二个参数a=-0.3786,tt=8.4853，按距离贴近原则，可作出中长期预报。     

乳酸菌蛋白水解力的测定及研究

试验采用邻苯二甲醛法,对８种乳酸菌共计３７株菌在适宜温度下发酵脱脂复原乳（ＮＦＳ：１１％）产生的游离氨基酸含量进行了测定。结果表明,嗜热乳杆菌（保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌）的蛋白水解力较高,其游离氨基酸含量可达３０３．８７ｍｇＬ－１（１４７．８５～４６６．５９ｍｇＬ－１）而乳球菌和干酪乳杆菌的蛋白水解力较低,一般为５０ｍｇＬ－１左右,其中保加利亚乳杆菌ＬＢ－１,３－１及瑞士乳杆菌ＬＨ的蛋白水解力最高,适宜于制作干酪。蛋白水解力随着发酵酸度及菌体生物量的增加而呈上升趋势,但乳球菌及干酪乳杆菌的变化不大。另外,对保加利亚乳杆菌ＬＢ－１与嗜热链球菌ＳＴ－１发酵乳样的氨基酸分析表明,天冬门氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸等是嗜热链球菌生长需要的氨基酸,均可由保加利亚乳杆菌分解乳蛋白提供。