秀珍菇S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(PpSAMS)的克隆与表达分析

在对不同生长阶段的秀珍菇样品进行高通量转录组测序的基础上,经分析筛选获得S-腺苷甲硫氨酸合成酶全长基因(PpSAMS).为了探究PpSAMS在低温刺激后秀珍菇原基形成过程中的功能与表达差异,从秀珍菇中克隆得到了PpSAMS基因,对其进行了系统分析,并利用实时荧光定量PCR的方法,分析该基因在低温刺激后原基形成过程中不同...     

浙江秀珍菇黄菇病病原菌的分离与鉴定

为明确引起浙江秀珍菇黄菇病的病原菌种类,通过对病原菌的分离纯化、致病性测定、全自动快速微生物质谱检测系统鉴定、脂肪酸甲基酯(FAME)鉴定及16S rRNA序列分析,将引起秀珍菇黄菇病的病原菌鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。研究结果可为该病害的有效防控提供理论依据。     

秀珍菇栽培技术改良

[目的]改良秀珍菇栽培技术,提高秀珍菇生物学转化率和品质。[方法]从菌料选择及配方、菌棒构造2个方面,改良秀珍菇栽培技术。[结果]改良后的配方不仅保留了常规栽培中配方所体现的所有特性,而且整体提高了秀珍菇的生物学效率,较大程度地提高了秀珍菇的出菇率。[结论]该研究为秀珍菇优质高产栽培提供理论依据。     

8个秀珍菇菌株遗传亲缘关系初步分析

利用ISSR分子标记技术对8个秀珍菇菌株进行分析,用NTSYS软件构建亲缘关系UPGMA聚类图。16条ISSR引物中,有8条ISSR引物多态性丰富,条带清晰。8条引物共检测到207个位点,其中多态性位点119个。在DNA指纹图谱中,引物P828、P974扩增条带多态性最高。UPGMA聚类分析结果显示,8个秀珍菇样本在遗传相似系数(GS)0.82处分成4个组,S1、S3分别单独聚为一类,S2、S5、S6聚为一类,S4、S7、S8聚为一类。结果表明,秀珍菇近缘种间具有丰富的遗传多样性,ISSR分子标记可有效鉴别秀珍菇及其同属近缘种,这为秀珍菇资源的收集和分类提供了理论依据。基于ISSR分子标记技术研究秀珍菇菌株的遗传多样性和它们之间的系统发育关系,可为秀珍菇种质资源分类鉴定和育种提供参考。     

秀珍菇种质资源的ITS-RFLP分析

对36个命名为秀珍菇的菌株进行ITS特异性扩增,结果显示菌株间没有多态性.根据ITS-RFLP及ITS序列,将36个菌株分为两类,第1类菌株包括Pl.g 0003、Pl.g 0006、Pl.g 0009、Pl.g 0016和Pl.g 0026,是糙皮侧耳,不是秀珍菇;余下31个菌株归入第2类,是凤尾菇,也不是秀珍菇.ITS-RFLP可应用于商业秀珍菇种性的鉴定.     

北京地区秀珍菇菌株遗传多样性的RAPD分析

[目的]找出一种适合秀珍菇的分子标记方法,研究其遗传多样性。[方法]应用RAPD技术对11株秀珍菇（Pleurotus geesteranus）菌株进行了遗传多样性分析。[结果]在供试的60条RAPD随机引物中,有13条可扩增出清晰、稳定的DNA条带。聚类分析表明,在相似系数0.820水平上,可将供试菌株分为4类：第1类包括土秀、灰平260、高平172、夏丰1号;第2类包括凤尾、秀珍菇、秀12、高678、秀18;第3类仅有3014;第4类仅有灰秀。[结论]该研究揭示了北京地区秀珍菇菌株的遗传多样性。     

秀珍菇的组织分离及生产应用的研究

秀珍菇是全世界广泛栽培的食用菌,是广大群众喜爱的蔬菜,也有很高的药用价值.秀珍菇具有很好的市场前景和经济效益。根据秀珍菇的生物学特性与生活习性,可采取三种组织分离方法对秀珍菇进行组织培养,通过了解其发展状况及存在问题,展望秀珍菇的生产及应用的研究。     

高海拔山区秀珍菇反季节栽培技术

秀珍菇是一种中温出菇，变温结实的珍稀菌类。以投资少、耗能低、产量高、质量好，实现秀珍菇的反季节生产一直是广大菇农追求的目标。人为的创造条件使其生长，技术相对复杂，操作也同样困难，无疑会提高生产成本，因此我们立足于杭州地区原材料及地理资源，充分利用自然条件，在海拔为500m以上的临安顶山开展了秀珍菇反季节栽培技术的研究。通过科学配料、温差刺激、催蕾护蕾、补水增养等措施，达到了秀珍菇在高温季节正常出菇的目的，并突破了秀珍菇反季节栽培的一些技术难题，同时也给欠发达的山区农村提供了一条利用自然优势来脱贫致富的路子。     

猪舍转产"姬菇-秀珍菇"栽培技术研究

在分析“姬菇-秀珍菇”栽培条件要求的基础上,阐明了猪舍转产“姬菇-秀珍菇”的生产季节与茬口安排,总结了猪舍转产“姬菇-秀珍菇”的栽培技术,并对猪舍转产“姬菇-秀珍菇”的产值与效益进行了分析。     

工厂化秀珍菇单潮爆发性出菇技术研究

传统反季节栽培秀珍菇培养基以木屑为主料,采收6～7潮,周期长,用工量大,栽培成本高。工厂化秀珍菇栽培量大,生产周期短,要求产量集中。为探索工厂化秀珍菇单潮爆发性出菇关键技术,本研究比较了秀珍菇不同菌株、培养基配方、发菌期等因素,发现适宜工厂化单潮爆出菇的优良菌株为金秀,最佳配方为棉籽壳15%、玉米芯15%、木屑26.5%、甘蔗渣20%、麸皮20%、豆粕2.5%、石灰1%,适宜开袋出菇的发菌期为70 d。     

环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫（Theileria annulata）可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞（即非转化宿主细胞）为试验材料,提取总RNA和mRNA,反转录合成cDNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交（SSH）,构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签（ESTs）364条,大小主要分布在350-1 200 bp之间;将这些ESTs序列在GenBank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条（其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列）和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。     

Identification and analysis of differentially expressed genes involved in dark-induced photoperiod response and senescence of soybean leaves by suppression subtractive hybridization

A cDNA subtractive library enriched for dark-induced up-regulated ESTs was constructed by suppression subtractive hybridization(SSH) from leaf tissues of soybean cultivar DongNong L13 treated with short-day(8-h light/16-h dark) and long-day(16-h light/8-h dark) conditions.A total of 148 clones were sequenced,representing 76 unique ESTs which corresponded to about 20% of 738 clones from the cDNA library and showed a significant up-regulation of at least three fold verified by dot blot hybridization.The putat...     

Gene Expression Profiles of Response to Water Stress at the Jointing Stage in Wheat

Drought is one of the most adverse environmental factors that impact on plant growth and reduce crop yields. To decipher the molecular mechanism of drought tolerance, we constructed a cDNA library using suppression subtractive hybridization （SSH） and dissected the gene expression profiles in seedling and jointing wheat plants after stress with PEG-6000. A total of 2 046 ESTs from the jointing stage library （J-Lib） were allocated to 961 contigs. Among the ESTs, 265 uni-genes in 12 categories were identified on the basis of sequence similarities and functional classifications. Most were known to be involved in protection, directly or indirectly, against water stress. To determine differences in gene expression profiles for water stress responses at the jointing and seedling stages, data from the J-Lib were compared with those from a 2- leaf seedling library （S-Lib） constructed by the same method. Significant differences were observed between the two libraries for function-known genes; signal transduction genes were far more active at jointing than at the seedling stage.     

蓝塘猪和大白猪消减cDNA文库与差异基因分析

 【目的】寻找肉质性状候选优势表达基因,研究猪肉质优良性状的遗传基础和分子机制。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建蓝塘猪和大白猪肌肉组织差异表达的消减cDNA文库,利用实时荧光定量PCR法研究基因的差异表达。【结果】获得61个有效克隆。对整个文库进行测序分析,获得47条有效序列。用BLAST在线软件与GenBank 和GenBank EST等数据库进行同源序列比较,发现其中有2条未知序列。对文库中所包含的MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3、HUMMLC2B、GNTN和Oaz等基因进行了实时荧光定量PCR检测,结果显示MYL1、LDHA、KPNA3、TPM3和HUMMLC2B这5个基因在蓝塘猪肌肉组织的表达量显著高于大白猪（P＜0.05）;GNTN和Oaz基因在大白猪肌肉组织中的表达量显著高于蓝塘猪（P＜0.05）。【结论】很多EST与肉质有关的重要基因具有很高的同源性,这些基因在蓝塘猪和大白猪中表达差异显著（P＜0.05）。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。     

番茄长花柱品系T431低温胁迫下正向差减文库的构建及ESTs分析

本研究以番茄长花柱品系T431为材料利用抑制性消减杂交技术(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)构建了低温胁迫下的番茄长花柱突变体SSH cDNA正向差减文库,获得398个阳性克隆.经菌液PCR和Reverse Northern Blot杂交方法结合剔除假阳性,利用BLAST在GenBank数据库进行序列相似性比对,获得有功能的ESTs 173个.通过对所获得的ESTs序列进行功能分类发现,其中参与初级代谢、能量代谢、抗病/防御反应和信号传导等过程的基因相对较多.此外,还有一些基因参与植物体内蛋白质合成与加工、物质运输、转运调控与生殖发育等过程.     

马铃薯块茎低温反应抑制差减文库的构建及鉴定

本研究以4℃(Tester)和20℃(Driver)处理的马铃薯野生种Solanum berthaultii的无性系CW2-1块茎为材料,构建马铃薯块茎低温反应抑制差减文库以进一步筛选差异表达基因。通过PCR鉴定后,获得了含有2 112个阳性克隆的差减杂交文库。采用反向Northern方法对差减文库进行筛选鉴定,得到274个含有显著表达差异基因（P/N>3）的阳性克隆。从274个克隆中挑选了53个克隆进行测序和同源比对分析,合并后获得29个代表不同基因的非重复序列片段,表明文库具有较高质量。并随机选取了其中4个EST进行基因表达分析,结果显示,在耐低温糖化的S. berthaultii块茎中,4℃下贮藏的块茎基因表达强度高于20℃贮藏的块茎;同在4℃贮藏条件下,S. berthaultii和易低温糖化栽培种E1的块茎中基因的表达量亦存在差异,证明所构建的差减文库富集了马铃薯块茎对低温响应的基因。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

软腐病菌诱导的大白菜抑制差减杂交文库构建及分析

利用抑制差减杂交技术构建了软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)侵染诱导的结球白菜叶片cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。随机挑取单克隆进行单向测序,获得1 107条长度大于100 bp、质量较好的ESTs序列。利用DNAstar5.0对上述ESTs进行聚类,共获取753个非冗余EST,包括有564个为单拷贝序列(Singletons)和189个重叠群(Contigs)。所获得的编码功能已知的EST有508个,将这些EST进行功能分类,可以看出所代表的基因参与植物体内的各种代谢反应,其中参与初级代谢和能量代谢的最多(33.3%),其次是参与抗病/防卫反应(12.6%)、再次为参与信号传导(11.4%)和蛋白质合成与加工(9.4%),参与细胞的结构与生长发育、物质运输、转录调控等过程的基因相对较少。RT-PCR分析结果表明,MAPK、SA、ROS等信号通路参与软腐病菌诱导的大白菜抗病防卫反应。