H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定

H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)是危害我国养禽业的主要病毒之一,造成了严重的经济损失。根据H9亚型AIV的HA基因设计了1对引物,建立了H9亚型禽流感病毒的RT-PCR鉴定方法。H9亚型AIV的HA基因预期扩增的目的片断长度为425 bp。对H9N2亚型禽流感病毒不同稀释度的尿囊液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10~(4.25)EID_(50)/100μL。建立的RT-PCR检测方法对H9、H3、H4、H5亚型AIV及新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等进行检测,结果仅有H9N2亚型AIV出现特异性目的条带,其他均未出现目的条带,与其他常见禽病病原无交叉反应;用建立的RT-PCR和病毒分离2种方法同时对10株H9N2亚型AIV和8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品进行检测,结果 2种检测方法的符合率达100%。说明该鉴定方法特异性强,敏感性较高。     

H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

[目的]建立可同时鉴别检测H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的二重RT-PCR检测方法。[方法]根据GenBank中H9和H10亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物之间的浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。[结果]特异性试验结果表明,该方法可以特异性扩增出H9和H10亚型AIV对应大小的目的条带,而对其余亚型禽流感病毒及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。同时,该检测方法对H9和H10亚型AIV的扩增下限均为5×10~4拷贝/μL。临床样品的检测结果表明其与病毒分离结果相一致(100%)。[结论]该研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可在一管内同时鉴别检测H9与H10两种亚型AIV,为H9与H10亚型AIV的监测提供了技术支撑。     

H5、H9亚型禽流感病毒及鸭坦布苏病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能同时快速检测H5、H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的多重PCR检测方法,根据GenBank发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因和DTMUV的NS5基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了同时检测H5亚型AIV、H9亚型AIV和DTMUV的多重PCR检测方法,对其特异性及敏感性进行检验,并在临床中进行初步应用。结果表明,该多重PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可同时扩增出大小分别为732bp(H9亚型AIV)、380bp(H5亚型AIV)、250bp(DTMUV)的特异片段,利用本试验建立的多重PCR对其他鸭病病原体进行扩增结果均为阴性,利用这3对引物对H5、H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测,结果显示最低检测极限分别为533pg·μL-1、56pg·μL-1和6.6ng·μL-1。对临床200份样品的检测结果表明该多重PCR检测方法具有快速、敏感、特异性强等优点,适用于临床检测应用。     

禽流感病毒H5,H7,H9亚型多重RT-PCR检测方法的建立

依据GenBank中亚洲流行株禽流感病毒(AIV)H5,H7,H9亚型血凝素基因及M基因序列保守区域设计特异性引物,利用多重反转录聚合酶链式反应技术建立了AIV及H5,H7,H9亚型的检测方法.该方法能一次性检测出AIV保守区域M基因的同时,直接区分H5,H7,H9亚型.对新城疲病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒等特异性检测均为阴性.样品经100倍稀释后仍能检出.     

禽流感病毒H7和N2亚型nano-dPCR检测方法的建立和应用

为建立一种同时检测H7亚型和N2亚型禽流感病毒（AIV）的双重纳米PCR(nano-dPCR)方法，从GenBank中分别下载H7亚型AIV的HA基因序列和N2亚型AIV的NA基因序列，采用Primer 7.0和Oligo 6.0软件设计了2对特异性引物，通过对nano-dPCR反应条件进行优化确定最佳反应体系；利用优化好的反应体系开展nano-dPCR方法的特异性和敏感性试验；采集活禽市场家禽咽喉及泄殖腔拭子样品进行临床样品检测并进行验证。结果表明，成功建立了一种同时检测H7亚型（723 bp）和N2亚型（314 bp）AIV的nano-dPCR方法，该方法特异性良好，其他亚型禽流感病毒及常见禽类呼吸道病毒均未出现特异性的条带，H7亚型AIV和N2亚型AIV的最低核酸检测量分别达到了5×103、5×103拷贝/μL，其敏感性是普通双重PCR检测方法的10倍，其对临床样品检测结果准确率达到100%，可以用于禽流感临床样品鉴别诊断和日常防控监测。     

鸭副粘病毒与H9亚型禽流感病毒双重PCR检测方法的初步建立

通过对GenBank发表的鸭副粘病毒(DPV)和鸭H9亚型禽流感病毒(AIV,H9)基因序列分析,针对保守区分别设计并合成2对特异性引物.通过对扩增条件的优化,建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法.结果表明,该检测方法可同时扩增出DPV (363 bp)和H9亚型AIV (732 bp)的特异性片段,而对照DHV、I...     

H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,并优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法。特异性实验结果表明,该方法可以特异性地扩增出H9、H10亚型AIV及M基因对应大小的目的条带,而对其余亚型AIV仅M基因出现特异性条带,其它禽病病原体均未扩增出任何特异性条带。敏感性实验结果表明,该方法对H9、H10亚型HA基因及M基因质粒的扩增下限均为5×10⁴拷贝/μL。此外,该方法对临床样品的检测结果与病毒分离及测序结果完全一致。     

H9和H10亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,并优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法。特异性实验结果表明,该方法可以特异性地扩增出H9、H10亚型AIV及M基因对应大小的目的条带,而对其余亚型AIV仅M基因出现特异性条带,其它禽病病原体均未扩增出任何特异性条带。敏感性实验结果表明,该方法对H9、H10亚型HA基因及M基因质粒的扩增下限均为5×10~4拷贝/μL。此外,该方法对临床样品的检测结果与病毒分离及测序结果完全一致。     

鸡细小病毒与H9亚型禽流感病毒二重PCR检测方法的建立

[目的]建立一种能够同时诊断鸡细小病毒(chincken parvovirus,ChPV)和H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的检测方法。[方法]根据GenBank中已发表的ChPV NS基因、H9亚型AIV HA基因的保守序列,分别设计多对引物,并通过一系列不同组合对温度和反应体系的调整试验,最终筛选出2对最佳特异性引物组合,建立了ChPV和AIV二重PCR检测方法用于ChPV和H9亚型AIV的检测。[结果]特异性和敏感性的试验结果表明,建立的二重PCR方法特异性良好,可以在一管PCR反应同时检测ChPV和H9亚型AIV。针对ChPV NS基因和H9亚型AIV HA基因的扩增片段大小分别为558和367 bp,其他常见的禽病病原体均未见阳性反应;该法对ChPV和H9亚型AIV的检测下限均为5×10~4拷贝/μL质粒;临床样品检测结果表明,对140份临床样品检测结果与AIV分离测序及ChPV PCR阳性产物测序结果完全一致。[结论]建立的ChPV和H9亚型AIV二重PCR检测方法不仅特异性良好,而且检测的灵敏度高,对ChPV和H9亚型AIV的监测及有效防控具有重要意义。     

一步法多重RT-PCR禽流感病毒分型诊断法的建立与应用

根据禽流感病毒(AIV)的M基因序列设计合成了1对AIVM基因的通用诊断引物AMDI／AMD2,针对H5N1、H9N2两种亚型的HA基因分型设计合成了2对分型诊断引物H15D1／H5D2,H9D1／H9D2。采用一步法多重RT-PcR技术建立了一种禽流感病毒快速分型诊断方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。结果表明,该诊断方法速度快,一般只需要28～30 h即可鉴定出结果,比病毒分离鉴定(5～7 d)至少缩短4～6 d;特异性强,试验组53株AIV全部扩增出与预期同样长度的目的条带,与病毒分离及血清学鉴定方法的检测结果完全一致。对照组中新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS76V)、传染性支气管炎病毒(IBV)均未扩增出特异性基因条带,;灵敏度高,试验组将AIV接种SPF鸡胚,培养后的鸡胚尿囊液(AAF)进行10-2稀释后,仍可以检测到其中的AIV。     

Development of a reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification assay to detect avian influenza viruses in clinical specimens

In recent years, the avian influenza has brought not only serious economic loss to the poultry industry in China but also a serious threat to human health because of the avian influenza virus(AIV) gene recombination and reassortment. Until now, traditional RT-PCR, fluorescence RT-PCR and virus isolation identification have been developed and utilized to detect AIV, but these methods require high-level instruments and experimental conditions, not suitable for the rapid detection in field and farms. In order to develop a rapid, sensitive and practical method to detect and identify AIV subtypes, 4 specific primers to the conserved region of AIV M gene were designed and a loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) method was established. Using this method, the M gene of H1–H16 subtypes of AIV were amplified in 30 min with a water bath and all 16 H subtypes of AIV were able to be visually identified in presence of fluorescein, without cross reaction with other susceptible avian viruses. In addition, the detection limit of the common H1, H5, H7, and H9 AIV subtypes with the RT-LAMP method was 0.1 PFU(plaque-forming unit), which was 10 times more sensitive than that using the routine RT-PCR. Further comparative tests found that the positivity rate of RT-LAMP on detecting clinical samples was 4.18%(14/335) comparing with 3.58%(12/335) from real-time RT-PCR. All these results suggested that the RT-LAMP method can specifically detect and identify AIV with high sensitivity and can be considered as a fast, convenient and practical method for the clinic test and epidemiological investigation of AIV.     

禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究

为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的多重RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性。     

禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法的建立

【目的】建立用于检测禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）且能同时区分H1和H3亚型AIV的方法,为有效防控禽流感（Avianinfluenza,AI）奠定基础。【方法】根据H1亚型、H3亚型AIV-HA基因和M基因的保守核苷酸序列,分别设计3对特异性引物,以含有H1亚型AIV和H3亚型AIV的cDNA为模板,对三重PCR扩增条件进行优化,验证其特异性和敏感性,并对临床样品进行AIV检测。【结果】H1和H3亚型AIV混合模板经三重PCR扩增可获得3条特异性条带,其中302bp为H1亚型HA基因、453bp为M基因、626bp为H3亚型HA基因;含有H1或H3亚型AIV的模板均出现两条特异性条带,大小分别为302和453bp、453和626bp;含有其他亚型AIV的模板仅出现一条特异性条带（453bp）;而其他禽呼吸道疾病病毒均未扩增出任何条带。优化后的三重PCR最低能同时检测出7.00pg的H1亚型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的H3亚型AIV;对100个临床样品进行AIV检测,AIV总阳性率为36%,其中H1亚型阳性率4%、H3亚型阳性率9%、其他亚型阳性率23%。【结论】禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等特点,适用于AIV的检测及H1和H3亚型AIV的分型检测。     

转基因玉米NK603品系成分LAMP快速PCR检测方法的建立

根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。     

猪细小病毒LAMP检测方法的建立

 【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的 LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23 TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼判断结果,与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP检测与免疫荧光鉴定、PCR方法比对,符合率均为20/20。【结论】本研究建立的PPV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单、设备要求低的特点,适合用于临床PPV快速检测。     

番鸭体内H5亚型禽流感HI抗体与抗感染关系研究

对经过H5N1油苗免疫的50日龄番鸭,按HI抗体水平分组后,进行人工接种HPAIV,通过试验鸭的临床症状、病理变化和排毒情况综合判断HI抗体水平与保护力之间的关系。结果表明,HI抗体水平在5.0log2以下时,番鸭群可感染HPAIV,出现临床症状,表现不同程度的病理变化,并有排毒现象。抗体水平达到3.0log2~5.0log2的免疫番鸭群已具有一定的抵抗力,可以延缓发病时间,降低发病程度。随抗体水平的升高,发病与排毒的程度有所下降。当抗体水平达6.0log2及以上时,番鸭对人工接种HPAIV具有完全抵抗能力,不排毒。因此,番鸭对H5N1亚型HPAIV具完全抵抗力的HI抗体水平的临界保护滴度为6.0log2。     

检测H9亚型AIV的压电免疫传感器的研究

[目的]研制检测H9亚型禽流感病毒的压电免疫传感器。[方法]用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜再通过N-乙基-N-′（3-二甲氨基）丙基碳化二亚胺盐酸（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）偶联抗H9亚型禽流感病毒的特异性单抗构建传感器芯片,建立可以检测H9N2亚型禽流感病毒的免疫传感器。[结果]该方法具有较好的特异性,不与H5亚型流感病毒和新城疫病毒（NDV）反应;检测灵敏度达到20~100EID50。[结论]该研究为深入研究检测禽流感病毒的免疫传感器奠定了基础,为其他相关病毒的监测提供了一种新途径。     

采用环介导等温扩增技术快速检测猪丹毒丝菌病原体

[目的]建立猪丹毒丝菌(E.rhusiopathiae)毒力株的快速检测方法.[方法]利用快速灵敏的环介导等温扩增技术( Loop - mediated Isotherml amplification,LAMP)针对丹毒丝菌spa基因较为保守区域设计4条特异性LAMP引物,采用FTA(Flinders technology associates,FTA)滤膜法提取12种血清型丹毒丝菌,8种非丹毒丝菌及受感染小鼠血液的基因组DNA,分析LAMP环引物的特异性;比较LAMP与传统PCR方法的扩增敏感性和产物特异性.[结果]在61℃恒温条件下,LAMP法能够特异性扩增丹毒丝菌特异条带,与常规PCR扩增结果一致;灵敏度实验表明LAMP法检测猪丹毒丝菌的检测下限为2 CFU/mL,较传统PCR的敏感性(大于20 CFU/mL)至少高10倍.LAMP方法与PCR方法都能在小鼠感染模型血样中检测到浓度为200CFU(10-7)/mL以上浓度的丹毒丝菌.[结论]LAMP法与FTA滤膜法相结合在检测丹毒丝菌中具有潜在的应用价值.