烟草谷氧还蛋白NbGRX1的亚细胞定位及抗旱功能研究

[目的]本文旨在分析烟草NbGRX1基因的亚细胞定位及抗旱功能。[方法]在前期研究中,我们从烟草中克隆了1个谷氧还蛋白基因NbGRX1,并对其表达特性进行了研究。在此基础上,对NbGRX1蛋白的亚细胞定位及抗旱功能进行研究。利用病毒介导的基因沉默,在烟草中沉默了该基因,并调查NbGRX1基因沉默后烟草对干旱的响应。同时采用农杆菌介导法,将NbGRX1基因转化至拟南芥中,筛选单拷贝插入的纯合转基因拟南芥进行后续研究,对转基因拟南芥及对照进行干旱处理,并分析其表型。[结果]亚细胞定位研究表明,空载体中的GFP(绿色荧光蛋白)定位在细胞质和细胞核中,GFP:NbGRX1的融合蛋白均匀分布在细胞质和细胞核中,因此可以推测NbGRX1蛋白能定位在植物的细胞核和细胞质中。病毒介导的基因沉默研究表明,NbGRX1基因沉默烟草与对照相比对干旱胁迫更为敏感,更容易出现黄化和萎蔫的症状,叶片相对含水量下降;NbGRX1基因超量表达的株系干旱能力明显高于对照。[结论]烟草NbGRX1基因能够提高植物的抗旱性。     

水稻OsBBR1基因的白叶枯病抗性研究

水稻Y73是疣粒野生稻和栽培稻‘大粒香’经不对称体细胞杂交产生的后代,它对水稻白叶枯病表现为高抗。Y73在接种白叶枯病菌株P10 (PXO124) 后,一个NBS-LRR类基因的表达量显著上调。为了研究该基因的水稻白叶枯病抗性,采用RT-PCR技术从Y73中克隆了该基因的CDS片段 (2 631 bp),将该基因命名为OsBBR1(Bacterial Blight Resistance-related gene 1),并且利用pCAMBIA1300双元载体分别构建了OsBBR1基因超表达及干涉载体,采用农杆菌介导的转基因方法获得了转基因水稻植株。接菌试验显示,抑制OsBBR1基因的表达,能减弱抗病材料Y73的抗性;而提高OsBBR1基因的表达水平,则能增强感病材料的耐病性。结果表明OsBBR1基因与水稻白叶枯病抗性直接相关。此外,OsBBR1基因亚细胞定位结果还显示,OsBBR1编码产物主要定位于水稻细胞膜和细胞核,表明该基因很可能与信号转导和下游基因转录密切相关。     

葡萄赤霉素合成相关基因克隆、亚细胞定位和表达分析

【目的】分离和克隆‘藤稔’葡萄内根-贝壳杉烯氧化酶基因（VvKO）、GA2-氧化酶基因（VvGA2ox2和VvGA2ox4）、GA3β-羟化酶基因（VvGA3ox4）和GA20-氧化酶基因（VvGA20ox1）等5个重要赤霉素合成相关基因的ORF序列,并对其进行亚细胞定位与表达分析。【方法】采用电子克隆方法克隆相关基因,构建亚细胞定位表达载体,基因枪转化洋葱表皮细胞后激光共聚焦显微镜下观察。并用半定量和荧光定量RT-PCR方法研究各基因的时空表达。【结果】成功克隆了5个基因的完整ORF序列,对上述基因在葡萄不同组织器官中的表达水平进行分析发现,它们在组织器官间的表达有强弱差异。其中,VvGA2ox2主要在果实中表达,VvGA2ox4主要在叶片和果实中表达,而VvKO、VvGA3ox4和VvGA20ox1则在花、叶片和果实中均有一定的表达。VvKO、VvGA2ox2、VvGA2ox4和VvGA3ox4与GFP融合蛋白仅在核内产生绿色荧光;而VvGA20ox1与GFP融合蛋白在细胞核和细胞质膜上均产生绿色荧光信号。【结论】克隆的5个基因与葡萄的花、果实以及营养器官的发育存在不同程度的联系,其中4个基因仅呈现出细胞核内作用的特点,而VvGA20ox1则表现出细胞核和细胞质膜定位的现象。     

棉花GbRvd的亚细胞定位及其超表达烟草抗病性分析

【目的】研究棉花NB-LRR家族基因GbRvd的亚细胞定位及超表达烟草的黄萎病抗性,为解析GbRvd介导的植物抗黄萎病机制提供依据。【方法】对真核表达载体pJCV52进行改造,在SpeⅠ酶切位点插入gfp,使其兼具亚细胞定位的功能,命名为GPJCV52。应用Gateway技术构建GbRvd的亚细胞定位和超表达载体,并分别转化农杆菌GV3101。利用生物信息学和农杆菌介导的烟草瞬时表达技术对GbRvd分别进行亚细胞定位预测与观察。采用农杆菌介导法转化烟草,并通过组织培养技术获得转基因植株。运用PCR对超表达GbRvd的烟草进行阳性植株筛选,且利用半定量RT-PCR对阳性转基因植株进行表达检测。制备棉花黄萎病菌孢子悬浮液,通过灌根法对T_3代转基因烟草株系进行接种,利用5级标准统计发病情况并计算病情指数。【结果】利用在线分析软件ProtComp预测GbRvd为一种胞外(分泌)蛋白;GbRvd的跨膜预测结果显示其包含3个跨膜域;在线分析软件Wo LF PSORT预测结果显示GbRvd在细胞膜、内质网及叶绿体的预测分值分别为7、3和1,表明GbRvd主要存在于植物细胞膜上。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术进一步对GbRvd的亚细胞定位进行观察,结果显示在单独表达GFP蛋白的烟草细胞中,荧光信号在细胞核、细胞质和细胞膜均有分布;而GbRvd与GFP融合表达后的荧光信号主要分布于烟草表皮细胞质和细胞膜。综合生物信息学分析和亚细胞定位观察结果,表明细胞膜和细胞质是GbRvd的主要分布位置。利用农杆菌介导和组织培养获得了转基因烟草植株,通过对转基因烟草植株的PCR检测显示,阳性转基因烟草植株能够通过PCR扩增出与预期大小一致的目的条带,而野生型植株未出现相应条带;阳性转基因烟草植株半定量RT-PCR同样能够检测出与预期大小一致的目的条带,由此表明GbRvd成功整合于烟草基因组并能够进行正常转录。对3个T_3代超表达烟草株系的黄萎病抗性进行分析,结果显示超表达GbRvd的烟草植株病情指数显著低于野生型对照植株,表明过表达GbRvd可有效提高植株对黄萎病的抗性。【结论】GbRvd主要存在于植物细胞质和细胞膜,其超表达可显著提高烟草对黄萎病的抗性。     

水稻OsNHX5基因的亚细胞定位及表达分析

采用PCR方法从水稻中克隆出1个Na~+/H~+逆转运蛋白基因OsNHX5,构建了该基因的亚细胞定位表达载体,利用注射烟草法对OsNHX5进行亚细胞定位,利用荧光定量PCR技术研究OsNHX5基因在盐胁迫下的表达模式。结果表明,OsNHX5与拟南芥AtNHX5和AtNHX6的亲缘关系较近,该蛋白定位于细胞内膜系统上;荧光定量PCR结果表明,叶中OsNHX5基因的表达受KCl胁迫诱导上调表达,而根中OsNHX5基因的表达变化不明显。OsNHX5是一个细胞内膜系统上的K~+/H~+逆转运蛋白,可为耐盐水稻的分子育种提供理论依据。     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位分析

为明确拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位情况,本研究构建了AtPLC2基因融合GFP标签的表达载体35S:PLC2-GFP,并通过农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化本氏烟草叶片,转基因烟草叶片细胞利用激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光信号与细胞质膜重合,表明拟南芥AtPLC2基因定位于细胞质膜上,研究结果为明确拟南芥AtPLC2基因的功能奠定了良好的基础。     

野大麦CIPK基因的亚细胞定位

为明确野大麦CIPK基因在植物亚细胞水平上的定位情况,以已知细胞质膜定位的拟南芥AtCBL1基因和液泡膜定位的AtCBL3基因作为参照,构建了这两个基因分别与红色荧光蛋白基因（RFP）融合的植物表达载体（参照载体）,以及野大麦CIPK基因与绿色荧光蛋白基因（GFP）融合的植物表达载体（目标载体）,利用基因枪转化法将参照载体和目标载体共转化洋葱上表皮细胞,瞬时表达后利用激光共聚焦显微镜进行共定位分析。结果表明,该基因主要定位于细胞膜和细胞核,为进一步深入分析该基因的功能提供了重要依据。     

桃脂氧合酶基因（PpLOX-3[KG-*3]）在洋葱表皮细胞中的定位表达

PpLOX-3是从桃果肉中克隆得到的一个基因,通过生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白可能定位于细胞质膜中。为进一步研究该基因功能,构建以绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)为报告基因的融合植物表达载体163Gpp-PpLOX-3,通过农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞。结果表明PpLOX-3定位在洋葱表皮细胞的细胞质膜中。     

真盐生植物盐穗木HcWD-40蛋白的亚细胞定位

[目的]WD-repeat蛋白是一类结构高度保守的蛋白质家族,常分布于细胞质或细胞核内,具信号转导、染色体组装,转录调控等多种功能.实验对极端耐盐的藜科真盐生植物盐穗木的WD-40蛋白进行亚细胞定位,初步探讨该基因参与盐穗木耐盐抗旱的机制.采用绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,对真盐生植物盐穗木HcWD-40基因的表达产物进行亚细胞水平定位.[方法]PCR扩增获得序列正确的HcWD-40,构建pCAMBIA 1301-1-HcWD-40-mGFP融合基因表达载体,采用伯乐(Bio-RAD)基因枪介导的方法转化到洋葱表皮细胞中,28℃暗培养16～24 h后,以仅表达GFP的洋葱细胞作为对照,利用激光共聚焦显微镜观察GFP在洋葱表皮细胞中的分布.[结果]重组载体pCAMBIA 1301-1-HcWD-40-mGFP可成功转入洋葱表皮细胞且HcWD-40蛋白正确表达.激光共聚焦显微镜检测结果表明该基因表达产物分布于细胞质与细胞核中.[结论]目的蛋白HcWD-40定位于细胞质和细胞核内,可能间接或直接参与多种细胞过程的调控.     

林烟草KUP/HAK/KT钾转运体基因NsHAK11的亚细胞定位与表达

【目的】应用生物信息学方法,分离和克隆烟草钾转运体KUP/HAK/KT家族新基因,对其进行亚细胞定位和表达分析,为开展烟草KUP/HAK/KT钾转运体的研究提供借鉴。【方法】通过生物信息学方法,搜索林烟草（Nicotiana sylvestris）和绒毛状烟草（N.tomentosiformis）基因组数据库,预测两种烟草中的钾转运体KUP/HAK/KT家族成员,构建系统进化树。根据所获结果,从林烟草中获得一个新的烟草KUP/HAK/KT家族基因。采用Wolf PSORT对蛋白的亚细胞定位进行预测,并利用农杆菌浸润法注射本生烟（N.benthamiana）叶片后激光共聚焦显微镜下观察,依据融合荧光蛋白在细胞内产生荧光的位置确定蛋白的亚细胞定位,用以验证预测结果;采用PLACE网站对基因的表达模式进行预测,并用荧光定量PCR分别研究其在盛花期林烟草不同器官的表达差异及低温、高温和低钾胁迫下苗期林烟草叶片中NsHAK11的表达变化,用以验证预测结果。【结果】预测出林烟草和绒毛状烟草KUP/HAK/KT钾转运体家族均含有19个成员,进化上分为4个Cluster（簇）。根据预测序列结果,从林烟草中克隆得到一个ClusterⅢ中的基因,其编码蛋白与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中AtKUP11的相似性最高,因此,将其命名为NsHAK11,其编码蛋白与已获得的2个烟草NrHAK1和NtHAK1的相似性仅为48%和49%,所以NsHAK11是一个新的烟草KUP/HAK/KT基因。Wolf PSORT预测显示NsHAK11主要定位于细胞质膜中。亚细胞定位试验中NsHAK11与GFP和DsRed2两种报告蛋白融合的定位结果均表明NsHAK11定位于细胞质膜中,与预测结果相符。利用PLACE网站对NsHAK11启动子分析得到,NsHAK11可表达与定位于根、花和胚芽组织中,受到低温、高温、干旱和激素等因素的影响。实时荧光定量PCR分析结果与预测结果基本一致：NsHAK11在盛花期林烟草各组织器官中均有表达,但表达水平存在强弱差异,其在主根中的表达量最高,在侧根中的表达量次之,而在叶片中的表达量最低;NsHAK11在苗期林烟草叶片中受低温、高温和低钾胁迫时呈现不同类型的上调表达,其中,低温处理时NsHAK11的表达上调程度最大且响应时间最早,高温处理时其表达上调程度次之,但在前期会出现明显抑制,低钾处理时其表达量可上调表达,但并不显著。【结论】获得了一个烟草KUP/HAK/KT基因家族新成员NsHAK11,其编码蛋白为主要定位于细胞质膜中的钾转运体,该蛋白广泛存在于各组织器官中,参与叶片响应低温、高温和低钾胁迫的应对机制。     

过表达CsMADSs拟南芥的表型变化及CsMADSs表达水平

为探究黄瓜CsMADSs的功能,构建了黄瓜CsMADS08及CsMADS21基因的真核表达载体并转化烟草,研究其在烟草中的亚细胞定位;同时通过农杆菌介导法转化拟南芥,经潮霉素筛选及分子检测,获得阳性株,观察转基因后代植株的表型变化情况;实时荧光定量PCR检测CsMADS08和CsMADS21在转基因后代植株各器官中的表达情况。结果显示,CsMADS08定位于细胞膜和细胞核上,而CsMADS21定位于细胞膜上。表型分析结果显示,过表达CsMADS08基因的拟南芥叶片发紫,侧枝少,且侧枝上出现莲座状的茎生叶;而过表达CsMADS21植株的侧生花序及果荚都比野生型多,且花期早,果实成熟早。荧光定量PCR结果显示,CsMADS08基因主要在茎中表达,而CsMADS21基因则主要在花中有高表达。该研究可为进一步明确黄瓜CsMADSs基因的功能及培育黄瓜新品种提供参考依据。     

菊花翻译起始因子4E基因的克隆、 表达分析及其互作蛋白的筛选

【目的】为了研究翻译起始因子4E在菊花中的表达特性及功能,克隆菊花翻译起始因子4E（CmeIF4E）基因,分析其表达特性并初步筛选得到菊花CmeIF4E的互作蛋白。【方法】根据已报道植物的eIF4E序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术克隆菊花eIF4E基因,荧光定量PCR及亚细胞定位分析菊花CmeIF4E的表达特性,并用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白。【结果】克隆获得菊花eIF4E基因全长914 bp,其开放阅读框（ORF）654 bp,编码1条包含218个氨基酸残基的多肽,将该基因名为CmeIF4E,GenBank登录号为JQ904591。氨基酸序列比对和系统进化分析表明,菊花CmeIF4E与已报道的莴苣的同源基因亲缘关系最近,该结果与植物分类学相符。荧光定量PCR分析结果显示,CmeIF4E基因在切花菊‘神马’各个器官中均有表达,幼嫩的根中表达量最高,其次是叶片,而茎中表达量最低。亚细胞定位分析发现,CmeIF4E在细胞的核、质、膜上都有表达。筛选得到菊花CmeIF4E互作蛋白,其中包括蛋白翻译和翻译后修饰、光合作用、抗逆和防御等相关蛋白。【结论】CmeIF4E在菊花组织中为组成型表达,亚细胞定位显示其在细胞核、细胞质、细胞膜上都有表达。候选蛋白分析验证了CmeIF4E在翻译起始中的作用,还推测其可能与光合系统、植物的抗逆防御相关,结果为进一步研究该蛋白在菊花中的作用提供了重要依据。     

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

雷竹PvJ3基因克隆及功能分析

拟南芥Arabidopsis thaliana中J3基因参与花期的调节,调控开花时间。为了探究竹类植物中J3基因的功能,根据植物中J同源基因的高度保守性,采用同源克隆技术从雷竹Phyllostachys vilascens中克隆出1个J3基因,命名为PvJ3。该基因的开放阅读框（ORF）区长为1 260 bp,编码419个氨基酸。通过同源比对和系统进化树分析,可知雷竹PvJ3蛋白和其他物种中J3同源蛋白的氨基酸序列同源性很高。通过实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）,发现PvJ3基因在同一竹鞭的笋、花芽、花,开花与不开花雷竹的茎秆、成叶、幼叶中都有表达,且开花雷竹茎秆中表达量最高,表明PvJ3基因在雷竹各组织部位都有表达。亚细胞定位分析结果显示,PvJ3蛋白定位在细胞质和细胞核。通过转化拟南芥对其功能进行了初步分析,表型统计结果显示,PvJ3转基因拟南芥与野生型相比,开花时间明显提早,而且出现多主茎现象,表明PvJ3可以促使植物提前开花并且参与植物茎秆的发育。     

谷子 SWI3基因鉴定及其在盐和干旱胁迫下的表达分析

SWI/SNF染色质重塑因子在植物的生长发育及逆境应答过程中起重要作用。本研究首先通过序列比对,从谷子基因组中鉴定出6个候选SiSWI3基因,分别命名为SiSWI3A、SiSWI3B、SiSWI3C1、SiSWI3C2、SiSWI3D1和SiSWI3D2。然后对上述基因的结构、编码蛋白、启动子元件、亚细胞定位等进行生物信息学分析和预测,结果表明：SiSWI3蛋白都含有SANT Motif,且亚细胞定位预测显示SiSWI3成员主要被定位在细胞核中;SiSWI3基因启动子区域含有大量与光响应、激素类应答、逆境应答、代谢调控等相关的顺式作用元件。最后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测这些基因在谷子苗期盐胁迫和干旱胁迫下的表达量变化,检测结果表明：SiSWI3基因受盐和干旱不同程度的诱导,说明SiSWI3基因参与谷子苗期盐胁迫和干旱胁迫应答。本研究所得结论为进一步探究SiSWI3染色质重塑因子在抗逆作物谷子的逆境响应中的功能和机制奠定了基础。     

鸡ANP32家族蛋白亚细胞定位及其在免疫器官中的表达特征分析

【目的】明确鸡ANP32家族蛋白的亚细胞定位及在不同月龄鸡免疫器官中的表达特征,为后续研究鸡ANP32家族蛋白与新城疫病毒（NDV）复制及其致病性的关系打下基础。【方法】分别构建鸡ANP32家族基因重组真核表达载体,转染HEK-293T细胞后进行诱导表达,利用Western blotting检测融合蛋白表达情况,并通过荧光观察分析融合蛋白亚细胞定位;同时采用实时荧光定量PCR检测ANP32家族基因在1～6月龄鸡免疫器官（脾脏、胸腺和法氏囊）中的表达水平。【结果】成功构建了鸡ANP32家族基因重组真核表达载体pEGFP-C1-ANP32A、pEGFP-C1-ANP32B和pEGFP-C1-ANP32E,转染HEK-293T细胞后得到正确表达,获得携带EGFP标签的融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFPANP32B和EGFP-ANP32E,其分子量分别为60.0、57.9和56.9 k D。亚细胞定位分析结果表明,融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFP-ANP32B和EGFP-ANP32E的荧光与细胞核荧光完全重合,即主要定位在细胞核。实时荧光定量PCR检测结果表明,ANP32家族基因...     

Cloning,localization and expression analysis of two fw2.2-like genes in small-and large-fruited pear species

Fruit size is one of the most important agronomic characters,which is mainly determined by cell number and cell size.However,our current knowledge about pear is largely unknown.Through counting of pear mesocarp cells at different stages,we found that the cell number,rather than the cell size,is responsible for the differences between small- and large-fruited cultivars.Fruit weight-2.2(fw2.2) is an important quantitative trait locus(QTL) affecting fruit weight in tomato and functions as a negative regulator in carpel cell division.To get more insights into this QTL in pear fruit development,we isolated two putative homologous fw2.2 genes,which were designated as fw2.2-like(PbFWL) genes.PbFWLs encode Cys-rich proteins with the CCXXXXCPC motif and belong to the PLAC8 superfamily.In addition,results from the subcellular localization indicated that PbFWLs were localized in the plasma membrane.The expression profile of the PbFWL genes by qRT-PCR showed they expressed higher in small-sized fruit cultivar than that in large-sized fruit cultivar during the cell division period.In summary,our data suggest that these two PbFWLs might be negatively related to the cell division in pear fruit.