杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生研究

以杂交鹅掌楸幼胚为外植体,进行体细胞胚胎发生研究.比较了亲本基因型、发育阶段、培养条件、生长调节物质和渗透压等对体细胞胚胎发生的影响.结果表明在以1/2MS培养基为基本成分,添加2.0～3.0mg@L-12,4-D的培养基上能够成功诱导胚性愈伤组织.以蔗糖为渗透剂,提高渗透压有利于体细胞胚胎发生;以MS为基本培养基附加ZT 1.0～4.0mg@L-1对体细胞胚胎诱导最有效;ABA的使用能有效控制畸形胚的产生;基因型、幼胚发育阶段及光照条件对体胚发生起着重要作用.     

落叶松体细胞胚萌发能力研究

[目的]研究落叶松体细胞胚萌发能力,为落叶松在应用方面规模化繁殖提供理论依据。[方法]以落叶松体胚性细胞系S287的成熟体细胞胚为材料,区分了落叶松体细胞胚的不同子叶形态;进行树脂切片及显微观察后,对其萌发能力进行了统计;并利用外源施用激素的方法研究了影响落叶松体胚再生成苗的重要因子。[结果]成熟的落叶松体细胞胚主要以四种形态存在,分别是正常子叶胚(NC≥4),裂生子叶胚(2NC4),杯状胚(NC=1)以及畸形胚。纵切结构观察显示前三种体胚都能发育出完整的SAM和RAM,萌发率依次为17.2%,12.4%和5.7%,而畸形胚不具有完整的SAM和RAM,在萌发培养基上不能生根,并很快死亡。针对萌发率低的现状,进一步施用不同浓度的GA3和IAA发现,只有2 mg·L-1IAA对落叶松体胚生根具有明显的促进作用,其萌发率达到了56%,且在后期存活率仍能保持较高水平。[结论]IAA在落叶松体细胞胚萌发中发挥重要的调控作用。     

杂交榛子体细胞胚发生研究

不同培养基、激素种类及浓度和外植体对杂交榛子体细胞胚直接和间接诱导的影响的结果表明,MS培养基为杂交榛子体细胞胚发生最佳培养基;激素对杂交榛子体细胞胚直接诱导无显著影响,均可诱导成熟植株;筛选出杂交榛子愈伤组织培养最佳培养为:MS+6-BA2.0 mg/L+NAA1.5 mg/L;再生植株分化最佳培养基为:MS+6-BA2.0mg/L+N AA1.5 mg/L转入MS+6-BA 5.0 mg/L+N AA 0.01+GA3 0.5 mg/L;杂交榛子体细胞胚发生以子叶诱导率最高,以龙榛胚性愈伤组织诱导率最高。     

杂交鹅掌楸体胚苗容器育苗基质筛选

为了筛选出适于杂交鹅掌楸体胚苗生长的容器育苗基质,以草炭土、黄心土、河沙、珍珠岩为原料,按照体积比配制成5种育苗基质,开展杂交鹅掌楸体胚苗容器育苗试验,探讨不同基质组成对生物量、苗高、地径等生长指标的影响,并采用苗木质量指数对容器苗的苗木质量进行综合评价。结果表明,5种容器育苗基质处理对杂交鹅掌楸体胚苗的生长指标有显著影响,其中处理T5 （草炭土﹕河沙﹕珍珠岩=30﹕3﹕2）容器育苗效果最好。     

植物磺肽素在杂交鹅掌楸体胚发生中的作用

植物磺肽素(PSK),是近年来发现的一种新型植物肽类生长调节物质,具有促进单细胞的分裂增殖等生理功能.以杂交鹅掌楸未成熟胚来源的体胚发生体系为材料,探索PSK-α在植物体胚发生中的作用.研究发现PSK-α能够促进细胞分裂和增殖,有利于胚性细胞的形成.在杂交鹅掌楸体胚发生初期添加0.1 mg·L-1的PSK-α可提高未成熟胚的脱分化率并能有效改善培养细胞的状态;0.5 mg·L-1的PSK-α能够促进胚性愈伤组织的形成和增殖;体胚形成后期添加0.8 mg·L-1的PSK-α利于其正常发育以及再生植株的培养.     

脱落酸和玉米素结合使用对杂交鹅掌楸体胚分化及发育的影响

【目的】探讨了不同浓度脱落酸(ABA)和玉米素(ZT)处理对杂交鹅掌楸体胚发生发育的效应,为杂交鹅掌楸大规模繁殖技术的建立提供理论依据。【方法】以15-5202基因型的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织为材料,比较在体胚分化阶段单独添加ABA以及同时添加ABA和ZT对体胚分化的影响;通过体胚发生数量统计、体胚生长状况观察等筛选出诱导效率高、体胚发育正常的体胚分化培养基。【结果】1)在体胚分化培养基中添加ABA对体胚的分化及成熟具有促进作用,添加0.5～1.5 mg·L^-1 ABA可加快体胚发育,且体胚形态正常;添加2.0～2.5 mg·L^-1 ABA时,虽使体胚分化率明显提高,但畸形胚比例增加;低浓度ABA处理30天后转入光培养2周体胚即可成熟;而未添加ABA处理的体胚在同样条件下未完全发育成熟,体胚呈白色、子叶淡黄色。2)在体胚分化培养基中同时添加ABA及ZT能提高体胚分化率及促进体胚发育; 2.0 mg·L^-1 ABA结合0.2～0.4 mg·L^-1 ZT处理后光培养2周,体胚形态发育正常,子叶分化明显,胚根健壮,生长状况较佳;未经过ZT处理的体胚生长发育较慢; ZT浓度高于0.6 mg·L^-1时体胚生长发育受到抑制,不利于体胚分化及成熟。【结论】在杂交鹅掌楸体胚分化培养基中添加2.0 mg·L^-1 ABA和0.2～0.4 mg·L^-1 ZT能够进一步提高体胚发生效率,促进体胚正常发育。     

杂交鹅掌楸组织培养技术研究初探

将杂交鹅掌楸的饱满冬眠顶芽接种培养在1／2MS（铵态氮与硝态氮的质量浓度比为1：1）培养基上14d后，继以改良Risser和White(1964）培养基上培养7d，两种培养基均含有IAA2．0mg/L。初始阶段的继代培养以在改良Risser和White(1964)（Ca^2 质量浓度减半）培养基上＋VB5 1mg/L Biotin 0.01mg/L IAA 2.0mg/L ZT3.0mg/L较为适宜。     

整地方式对杂交鹅掌楸体胚苗及其亲本幼林生长的影响

在南京市浦口区选择两丘陵岗地,采取人工挖穴和机械全垦两种不同的整地方式,种植1年生杂交鹅掌楸体胚苗、鹅掌楸和北美鹅掌楸等5种不同遗传材料。3年生时,观测树高和离地10 cm处直径,并计算树干体积。试验结果表明,土壤板结的岗地,经机械全垦方式整地的鹅掌楸林,无论是树高、地径还是树干体积指标,都明显要优于人工挖穴造林的生长量。在机械全垦整地方式下,以体细胞胚胎发生的杂交鹅掌楸生长最好;在人工穴垦整地方式下,美国种内杂种1～3号生长与杂交鹅掌楸虽有差异,但在统计上没有显著性。说明在土壤板结的丘陵岗地,通过整地方式改善土壤疏松性和透气性,对于鹅掌楸的生长量的提高有重要作用。同时试验结果表明,在两种不同整地方式下,树高、地径和树干体积均以中国马褂木的生长量最小。     

杂交鹅掌楸间伐试验

对7年生杂交鹅掌楸进行间伐试验,结果表明,间伐2 a多后,在2 m×4 m、4 m×4 m和4 m×6 m 3个间伐密度中,2 m×4 m和4 m×4 m两者的胸径增长十分相近,为31.5%,密度4 m×6 m胸径增长最大,为45.4%,它与密度2m×4 m或4 m×4 m比较有44%的增长。     

天山云杉体细胞胚的成熟及萌发条件

【目的】建立天山云杉体细胞胚成熟及萌发阶段的适宜培养条件,为该树种的体细胞胚大规模繁殖和工厂化生产提供基础。【方法】以天山云杉成熟合子胚为外植体所诱导形成的胚性愈伤组织为材料,通过14个株系、4种成熟培养基、接种量(100、150、200mg的新鲜胚性愈伤组织)、ABA浓度(1.9、3.8、7.6、19、38μmol·L^-1)等体细胞胚成熟培养条件,以及对不同起源(体细胞胚、合子胚和种子)的幼苗形态特征的比较,筛选出最优的天山云杉体细胞胚成熟与萌发条件。采用SPSS18.0等统计软件对体细胞胚进行统计分析。【结果】1)天山云杉14个株系诱导体细胞胚的结果表明,不同株系在同一成熟培养基上诱导体细胞胚的数量存在差异;其中4个株系及其接种量对体细胞胚形成数量影响的结果表明,不同株系及其接种量诱导体细胞胚的数量也存在差异,当接种量为100mg时,T36株系的体细胞胚诱导数量最高,为3470±546个,显著高于其他接种量和株系(P<0.05)。2)在4种不同成熟培养基上,均形成了成熟的体细胞胚,在1/2BLG+30g·L^-1麦芽糖培养基上形成的体细胞胚数量高于其他培养基,分别为2044个(T6株系)和2282个(T36株系),且与其他培养基差异显著(P<0.05)。3)不同ABA浓度对天山云杉体细胞胚诱导数量的影响无显著性差异(P>0.05),在ABA浓度为1.9~38μmol·L^-1时,其体细胞胚平均诱导数量为2850~2913个,其中以7.6μmol·L^-1ABA的浓度处理效果较好,平均获得2913个正常体细胞胚,高于其他处理。4)将不同起源(体细胞胚、合子胚和成熟种子)萌发的小植株进行对比,结果表明,体细胞胚和合子胚幼苗发育阶段基本一致,但合子胚的幼苗比体细胞胚的幼苗约大1倍,但二者间差异不显著(P>0.05);体细胞胚与合子胚子叶的平均数量一致,二者无显著差异(P>0.05),多数幼苗子叶数量为7~8个。【结论】天山云杉体细胞胚成熟阶段的适宜培养条件为胚性愈伤组织接种量100mg,1/2BLG培养基添加7.6μmol·L^-1的ABA及75%PEG4000、30g·L^-1麦芽糖,并添加750mg·L^-1的L-谷氨酰胺或50mg·L^-1L-天冬酰胺。不同株系在诱导体细胞胚的数量上存在差异。体细胞胚再生植株与合子胚植株在形态上相似。研究结果可为天山云杉体细胞胚的大规模繁殖和工厂化生产提供基础。     

日本落叶松体细胞胚胎发生的研究

日本落叶松日永 10、日永 6 9和日草 34三个优株 ,将其未成熟种子和成熟种子的胚及成熟种子萌发的胚根、胚轴和绿色愈伤组织 5种外植体进行体细胞胚胎发生的试验 ,其中只有未成熟胚诱导出胚性愈伤组织 ,筛选出1)胚性愈伤组织诱导培养基 :S培养基 6_BA 0 5mg·L- 1 KT 0 5mg·L- 1 2 ,4_D 1 0mg·L- 1 ;2 )胚性愈伤组织保持与增殖培养基 :S培养基 6_BA 0 2 5mg·L- 1 KT 0 2 5mg·L- 1 2 ,4_D 0 1mg·L- 1 ;3)成熟体细胞胚诱导培养基 :S培养基 ABA 15mg·L- 1 PEG4 0 0 0 10 0g·L- 1 。以上 3种培养基均需附加蔗糖 30g·L- 1 ,谷氨酰胺 4 5 0mg·L- 1 ,水解酪蛋白 5 0 0mg·L- 1 ,凝胶 (Sigma#) 3g·L- 1 ,pH5 8。 4 )体细胞胚萌发培养基 :S培养基 ,不加任何激素 ,附加蔗糖 2 5g·L- 1 ,凝胶 (Sigma#) 3g·L- 1 ,pH5 8。     

杉木成熟合子胚器官发生和体胚发生

以杉木成熟合子胚为起始外植体,研究基本培养基、不同种类的细胞分裂素及生长素对杉木器官发生和体胚发生及不定芽生根的影响,并用石蜡切片法观察不定芽和体胚的发生和发育过程.结果表明:DCR 6-BA 1.0mg·L-1 TDZ 0.002 mg·L-1 NAA 0.1 mg·L-1对成熟合子胚诱导不定芽最有效;DCR 6-BA 1.0 mg·L-1 TDZ 0.003mg·L-1 NAA 0.1 mg·L-1是成熟合子胚诱导体胚的最佳培养基;不定芽在DCR基本培养基中可有效伸长;1/4MS IBA 0.2 mg·L-1 NAA 0.1 mg·L-1对不定芽生根最有效.石蜡切片观察表明:不定芽有2种发生方式,一种是表皮及表皮下的3～4层细胞分生组织化发育而成,另一种是外植体内部的小维管束脱分化发育而成.2种发生方式均为直接器官发生途径.     

栓皮栎体胚的增殖、成熟和萌发

以栓皮栎实生苗叶片为外植体诱导体细胞胚胎发生,调查碳水化合物、渗透剂和植物生长调节剂对体胚增殖、成熟和萌发的影响,建立体胚增殖、成熟和萌发的培养基方案.叶片外植体在附加1.0 mg·L-1NAA和0.5mg·L-1BA的起始培养基上诱导形成前胚性团块.这些胚性团块在增殖培养基上培养6周,在附加1 mg·L-1BA、0.25 mg·L-1NAA和3%蔗糖的MS培养基上增殖效果最好.将单个体胚转接到成熟培养基上进行培养,蔗糖浓度对栓皮栎体胚成熟以及后续的萌发有显著影响.成熟培养基中附加5%的蔗糖,体胚成熟率和萌发率分别达到63.5%和33.8%.虽然在成熟培养基中附加ABA有利于体胚成熟,但对体胚的进一步萌发没有促进作用.为了提高萌发率,成熟体胚在附加植物生长调节剂的萌发培养基上进行培养,以及进行预冷处理.成熟体胚4℃冷处理没有促进胚根和上胚轴的发育萌发.在附加0.5 mg·L-1BA和0.25 mg·L-1 IBA的1/2 MS萌发培养基上,体胚萌发率达到65.9%,再生植株转化率达到9.4%.     

鹅掌楸不同种源无性系嫁接母树林营建技术研究初报

利用7个种源鹅掌楸无性系枝条，采用高砧腹接换冠和切接两种方法，营建嫁接母树林。并对定植2a的5个种源树高生长量进行调查分析。     

火炬松体细胞胚胎发生体系的优化

目的 建立和优化火炬松体胚发生技术体系,为火炬松优良基因型体胚繁育及遗传转化体系建立提供技术支撑。 方法 以火炬松优良基因型的未成熟合子胚为材料,从基因型、球果采集期、基本培养基、植物外源激素组合及浓度等方面对胚性愈伤组织诱导条件进行优化;选取增殖效果好、具有胚性胚柄细胞团（ESM）的胚性愈伤组织开展体胚成熟的正交试验,选择发育正常的子叶胚进行萌发,8周后移栽。 结果 基因型、球果采集期、基本培养基和外源激素(PGR)组合及浓度等因子均对胚性愈伤组织诱导有不同程度的影响。火炬松6种基因型中荣山52胚性愈伤组织诱导率最高,达63.33%;处于裂生多胚期的合子胚为外植体的最佳采样期（7月20日左右）;6种基本培养基中,在DCR基本培养基上胚性愈伤组织诱导率最高,达40.00%;不同PGR组合及浓度中,以0.5 mg·L−1 6-BA+1.0 mg·L−1 2,4-D + 2.0 mg·L−1 NAA + 5.0 mg·L−1 ABA的胚性愈伤组织诱导率最高,达50.00%。胚性愈伤组织在基本培养基MLP上培养14 d后,转入含有ABA 8.0 mg·L−1、PEG 8000 140 g·L−1以及麦芽糖40.0 g·L−1的体胚成熟分化培养基上,体胚发生数平均为411个·g−1,体胚萌发率可达93.33%;体胚苗移栽成活率可达86.30%。 结论 本研究优化了火炬松胚性愈伤组织诱导与体胚发生技术体系,体胚诱导率显著提升,为火炬松良种规模化繁育及遗传转化提供技术支撑。     

Somatic embryogenesis of Pinus sylvestris

Embryogenic cultures (EC) of Scots pine (Pinus sylvestris L.) were initiated from immature embryos. Whole ovules were used as expiants. The responsive period for initiation began just after fertilization and remained throughout the development of first stages of early embryos. The main part of the embryogenic cultures were initiated by the time of cleavage polyembryony. Strong correlation was obtained between degree days and the responsive period. During subsequent years the experiments were repeated in Finland and Sweden. In all cases the responsive period for initiating embryogenic cultures was the same, about two weeks after fertilization.

In 1991–1993, a total of 138 clones of elite pine trees were tested for their ability to initiate embryogenic cultures. Of these, 33% were responsive under our experimental conditions. Based on about 300 ovules per clone the number of embryogenic lines induced by the responding clones varied from 0.2% to 9.0% of the expiants.

Several nutrient media were found to be suitable for initiation and proliferation of ECs. About half of the cell lines responded to abscisic acid by producing maturing embryos. The embryos reached full maturity in cultures of only a few cell lines. Some of the embryos that produced roots were planted in soil and transferred to a greenhouse.     

肉桂离体胚超低温保存研究

对不同含水量肉桂离体胚进行超低温(LN2)保存,采用不同冷冻方式、解冻方式及防冻剂预处理,并测定超低温保存前后的脱氢酶、电导率、α-淀粉酶生理生化指标。结果表明:超低温保存的技术关键是减少保存材料在脱水过程中所受的伤害,以及采用适宜的冷冻和解冻方式和添加适宜的防冻剂。防冻剂预处理可以适当提高保存含水量,增加含水量范围。肉桂离体胚没有添加防冻剂时最适宜保存含水量为30%~40%(w∶w),采用快冻快解处理。防冻剂预处理后的保存效果比没有防冻剂预处理的更佳,采用缓冻快解或快冻缓解处理较为适宜。     

miR396在落叶松体细胞胚胎中的功能研究

[目的]探讨miR396在落叶松体细胞胚胎发生中的功能.以期该研究能为解决体胚发育中子叶畸形胚与生根率低的问题提供新的视角,同时也为进一步揭示体胚发育的分子调控网络做基础铺垫.[方法]构建pre-miR396超表达载体,通过农杆菌介导侵染,将pre-miR396转入落叶松胚性细胞中,筛选稳定抗性细胞系.在DNA与RNA水平上,对抗性细胞系进行的鉴定、检测,同时统计比对其与野生细胞系间发芽率、叶片数目以及生根率的差异.[结果]在抗性细胞系基因组中,扩增出HTP与miR396的特异性片段,且无农杆菌Virg基因片段.RNA表达水平上,抗性系pre-miR396与miR396表达皆增加,而靶基因LaGRFs的表达量下调.统计表明抗性系胚的发芽率、生根率、叶片数目畸形率分别为70.60%、0.60%、37%,而野生型分别为92.50%、10.55%、4%,抗性系胚的发芽率、生根率显著降低(Sig.=0.000),叶片数目畸形率显著增加(Sig.=0.000).[结论]miR396在落叶松体细胞胚胎发生过程中,可能通过负调节靶基因LaGRFs的表达或者通过LaGRFs影响与它相互作用的基因,参与体胚子叶原基细胞代谢,从而影响了子叶与叶片的发育;通过负调节LaGRFs或者其它与根部发育相关的靶基因,影响了根端分生区细胞的活动,参与调控根的发育.