中国芦荟AlDREB2基因的克隆及其胁迫表达

 为了研究中国芦荟的抗逆机理, 以cDNA为模板, 利用3′RACE和PCR扩增方法, 克隆得到了一个编码DREB蛋白的基因, 命名为AlDREB2, GenBank登录号为FJ560460。其cDNA序列全长为886bp, 包含一个636 bp的开放阅读框, 推导编码的氨基酸序列(212个氨基酸) 与库拉索芦荟AlDREB1的序列相似性很高。进化树分析结果将AlDREB2 归入DREB 亚家族中A26亚组。利用RT-PCR 技术分析了AlDREB2 基因的表达与胁迫的关系, 表明AlDREB2 基因在非生物胁迫与生物胁迫中能够被不同程度诱导表达。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

八棱海棠肌动蛋白基因(MrACT)的克隆及分析

以八棱海棠(Malus micromalus Makino)为材料,抽取RNA,反转录成cDNA。采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法,5’-RACE获得长度1121bp的片段、3’-RACE获得883bp的片段,再通过设计引物扩增得到八棱海棠中一种肌动蛋白基因的cDNA的全长序列。该序列全长1134bp,推测其编码377个氨基酸,等电点为5.16,其编码的氨基酸与拟南芥(Arabidopsis thaliana)actin7编码的氨基酸只有2个氨基酸差别。通过对八棱海棠MrACT基因的表达分析,发现在不同组织中,该基因的表达水平没有明显差异,本文为进一步利用RT-PCR技术,以MrACT基因为内标,研究八棱海棠其他基因的丰度打好基础。     

南瓜肌醇单磷酸酶基因CmIMP1和CmIMP2的克隆与表达分析

以中国南瓜（Cucurbita moschata）为试验材料,利用同源克隆和南瓜转录组unigene序列获得2个IMP基因的全长cDNA序列,将两个基因命名为CmIMP1和CmIMP2,GenBank登录号为KP735607和KP735608。CmIMP1基因cDNA全长1 053 bp,包含1个810 bp的ORF,共编码269个氨基酸;CmIMP2基因cDNA全长945 bp,包含1个807 bp的ORF,共编码268个氨基酸。序列分析发现两个基因均含有磷酸酶家族锂敏感的3个特殊结构域,系统进化树分析表明这2个南瓜CmIMP与其他植物IMP有较高同源性（63.8% ~ 94.0%）,并与葫芦科作物最接近。采用荧光定量PCR研究CmIMP在各组织及逆境条件下的表达模式显示,其表达具有组织特异性,在叶中表达最高,须和幼果次之;盐胁迫和干旱胁迫可强烈诱导CmIMP表达,ABA对CmIMP的诱导较微弱,推测CmIMP在南瓜响应非生物胁迫的分子调控机制方面发挥重要作用。     

香樟两个DREB1转录因子基因的分离及其对不同胁迫的响应分析

以香樟（Cinnamomum camphora）实生苗为试验材料,利用同源克隆结合RACE技术获得了两个冷诱导转录因子基因CBF/DREB1的cDNA全长序列,命名为CcCBFc和CcCBFd,GenBank登录号分别为KP336741和KP336742。序列分析显示这两个基因均没有内含子,cDNA全长为897和1 010 bp,开放阅读框分别为654和621 bp,编码217和206个氨基酸,预测蛋白分子量分别为24.0和22.9 kD,等电点分别为5.26和8.58。基于氨基酸序列的同源性比对和系统进化树分析表明,这两个基因均属于DREB1家族,与双子叶植物进化关系较近。实时定量PCR结果显示,CcCBFc和CcCBFd都能被低温（4 ℃）、干旱（20%PEG）、盐（250 mmol ? L-1 NaCl）和ABA（100 μmol ? L-1）诱导,表明CcCBFc和CcCBFd可能在香樟应对非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

cDNA文库与RACE方法结合克隆马铃薯DnaJ -like基因全长cDNA

 以青枯病菌小种3号(生化变种2) PO41诱导24 h和48 h的马铃薯抗青枯病基因型ED13叶片为材料, 应用SMART技术构建了一个富集青枯病抗性相关基因的cDNA文库。继而利用RACE技术与该cDNA文库相结合克隆了一个马铃薯分子伴侣基因的全长cDNA。该cDNA长735 bp, 5′端有25 bp的非翻译区, 3′端具有完整的polyA 尾, 包含一个编码177 个氨基酸的完整开放阅读框架( GenBank 登录号:DQ885360) 。该分子伴侣基因与拟南芥DnaJ-like 20的部分核苷酸序列具有84%的一致性, 与其编码的氨基酸序列具有59%的一致性, 暂命名为StDnaJ。目前在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。半定量RTPCR结果表明, 该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节, 可能在青枯病菌和茉莉酸胁迫下具有促使胁迫损害细胞恢复活性的功能。     

桦褐孔菌纤维素酶基因的克隆与原核表达

成功获得了桦褐孔菌(Inonotus obliquus)JL 01菌株的内切葡聚糖酶(IO-EG)和β-葡萄糖苷酶(IO-BGL)的cDNA全长序列.eg2基因cDNA序列全长(ORF)为1149 bp,编码382个氨基酸,bgl2基因cDNA序列全长(ORF)为2583 bp,编码860个氨基酸;成功构建了30a-eg2和30a-bgl2大肠杆菌表达菌株,诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析表明两个菌株均表达蛋白,且蛋白以包涵体形式存在,为桦褐孔菌高效外源基因表达系统的建立提供了基础.     

白姜花倍半萜合成酶基因的克隆及表达

以白姜花的叶片为材料,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆到一个倍半萜合成酶基因的cDNA序列,其全长为1 932 bp,基因编码区共1 653 bp,编码551个氨基酸,命名为Hc-Sesqui。该基因编码蛋白的氨基酸序列与姜和玉米中的倍半萜合成酶有较高的同源性,并且含有DDXXD保守序列。通过Clustal.X进行序列分析,确定该基因属于植物萜类合成酶基因家族中的Tps-a亚族。Northern杂交的结果表明,该基因在茎、叶和萼片中均有表达。     

基于EST数据库的葡萄APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

APETALA2(AP2)是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2基因cDNA序列作为模板,对葡萄EST数据库进行同源检索筛选,电子克隆出葡萄AP2基因(Vv-AP2)cDNA序列。以香悦葡萄花cDNA为模板,根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA序列设计特异引物,分别利用RACE技术和特异PCR技术获得该基因3’末端和5’末端,序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA全长。该cDNA的全长为2 208 bp,命名为Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1 536 bp完整的开放读码框(ORF),其5’与3’末端非翻译区分别为268 bp和376 bp。其中,3’末端含有28 bp的Ploy+(A)。该基因在GenBank基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA共编码了511个氨基酸,具备完全保守的核定位信号序列(KKSR)以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中,Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

DREB1A regulon expression in rd29A:DREB1A transgenic chrysanthemum under low temperature or dehydration stress

Summary

Previously we reported that expression of the Arabidopsis DREB1A gene in chrysanthemum conferred increased tolerance to low-temperature and dehydration stresses, and that transgenic plants in which the DREB1A gene was driven by the abiotic stress-inducible promoter, rd29A, were more tolerant than those plants in which the DREB1A gene was driven by the 35S Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) promoter. To understand the molecular basis for this improved tolerance, we isolated 74 DREB1A regulon genes using suppression subtractive hybridisation, then compared their expression patterns in rd29A:DREB1A transgenic plants (rd29A plants) and in 35S:DREB1A transgenic plants (35S plants) under different stress conditions. Our results showed that the increased tolerance to low temperatures and dehydration in rd29A plants was attributed to increased levels of expression of different members of the DREB1A regulon. Levels of expression of 69% or 91% for members of the DREB1A regulon that showed upregulation in rd29A plants were highly correlated with the level of expression of DREB1A in response to low temperature or to dehydration, respectively. These results support the hypothesis that the increased tolerance of rd29A plants to abiotic stresses resulted from elevated expression of the DREB1A regulon.     

转沙冬青锌指蛋白基因AmZFPG 烟草非生物胁迫抗性分析

 分析了沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）锌指蛋白基因AmZFPG 在非生物胁迫下的表达 特性,结果显示AmZFPG 受低温、干旱、高盐胁迫诱导表达,表明该蛋白参与多种胁迫相关的信号转导 和应答反应。为进一步探索AmZFPG 的功能,构建了真核表达载体AmZFPG-pCAMBIA2300,将该基因 转入烟草（Nicotiana tabacum L.）,对转基因烟草T1 代进行非生物胁迫分析,结果显示,转基因烟草的耐 寒性、耐旱性、耐盐性均获得了提高。     

蝴蝶兰AP2/ERF家族基因的克隆及在低温下表达特性分析

用RT-PCR方法从‘大辣椒’蝴蝶兰叶片中克隆得到4个AP2/ERF家族基因，命名为PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4。蛋白结构域和序列比对发现PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4均含有1个AP2结构域， PhAP2/ERF2还含有1个B3结构域。进化树分析表明4个蛋白与兰科AP2/ERF家族成员亲缘关系最近，PhAP2/ERF1属于AP2/ERF家族DREB亚家族中的A1类，PhAP2/ERF2属于RAV亚家族，PhAP2/ERF3属于ERF亚家族的B4类，PhAP2/ERF4属于DREB亚家族中的A2类。用实时荧光定量PCR方法检测低温驯化和低温胁迫条件下PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4在‘大辣椒’和‘富乐夕阳’蝴蝶兰叶片中的表达特性，结果表明：4个基因在‘大辣椒’叶片中的表达趋势一致，表达量在低温胁迫早期达到最高，在胁迫中晚期有所下降；而4个基因在‘富乐夕阳’叶片中的表达趋势有较大差异，PhAP2/ERF1和PhAP2/ERF2的表达在低温处理整个过程中没有被诱导或仅有较小幅度增加，PhAP2/ERF3对低温的响应时间显著晚于‘大辣椒’，PhAP2/ERF4的表达趋势与‘大辣椒’差异较小。蝴蝶兰AP2/ERF在抗冷品种‘大辣椒’和不抗冷品种‘富乐夕阳’叶片中的表达差异暗示AP2/ERF基因家族在蝴蝶兰低温胁迫响应中起重要调控作用。     

DREB类转录因子及其在植物抗逆基因工程改良中的应用进展

DREB(Dehydration responsive element-binding protein)转录因子即脱水应答元件结合蛋白质能特异结合启动子中含有的DRE/CRT(Dehydration-responsive element/C-repeat)顺式元件,激活许多逆境诱导基因的表达,增强植物对逆境的忍耐力。文章综述了DREB类转录因子的结构特征、功能、基因表达调控机制及其在植物抗逆基因工程改良中的应用等方面的研究进展。     

野生马铃薯材料苗期耐冻性鉴定

采用人工冷冻鉴定、聚类分析结合田间自然霜冻鉴定的方法,对马铃薯野生种Solanum acaule的后代无性系材料的耐冻性和耐冻类型进行评价。在冷驯化前有11份材料属于霜冻敏感型,12份属于耐冻型,2份属于强耐冻型;而冷驯化后,霜冻敏感型减少到3份,耐冻型和强耐冻型材料分别增加到12份和10份。试验材料冷驯化前后的LT50和冷驯化能力与田间自然霜冻评价结果的相关性均达极显著水平,相关系数分别为0.50、0.91和-0.55。因此人工冷冻鉴定结果可以在一定程度上预测马铃薯材料在田间的霜冻耐性。     

Cold tolerance and short day acclimation in perennial Gaura coccinea and G. drummondii

The use of related species to integrate important traits into cultivated crops is a common practice in plant breeding. Gaura coccinea and, potentially its derived species Gaura drummondii, could be donor species for introgressing cold tolerance into non-hardy G. lindheimeri. However, cold tolerance and acclimation has not been studied in these species, so protocols for determining these traits are required. The objectives of this study were to determine the relative cold tolerance of G. coccinea, G. drummondii and whether short day photoperiod is involved in cold acclimation. G. drummondii from Texas, USA and G. coccinea from Minnesota and Texas, USA were subjected to freezing tests using whole plant or electrolyte leakage after natural acclimation or non-acclimation conditions. Minnesota genotypes were able to withstand colder temperatures (−12 °C) than Texas genotypes (−9 °C). Acclimation capacity was determined for whole plant and electrolyte leakage assays using three different plant organs—stem, crown, and rhizome. Underground rhizomes were the best predictors of cold tolerance, however they were difficult to obtain. Stem sections of G. drummondii (Texas) and G. coccinea (Minnesota and Texas) were used to determine a shift in acclimation under short days. The Minnesota G. coccinea genotypes demonstrated greater cold tolerance after 3 weeks of short days while Texas G. coccinea, G. drummondii genotypes did not change even after 5 weeks.     

The influence of temperature,daylength and calendar date on cold tolerance of Rhododendron

Summary

Physical factors changing the acclimation and deacclimation processes that lead to cold (frost) tolerance and susceptibility in Rhododendron cv. Hatsurgiri are reported. Interactions between photoperiod and temperature which encouraged acclimation were studied by exposing detached leaves 0°C to –10°C, and assessing resulting injury using ion efflux and visual scoring. Combinations of short days (8 h) and exposure to 5°C resulted in the greatest cold tolerance. Exposure to long days (18 h) or 20°C reduced the cold tolerance of leaves. Application of each environmental factor, separately, increased cold tolerance compared with control tissues. When photoperiods were maintained at 12 h, exposing leaves to 5°C during the dark period enhanced cold tolerance compared with a 20°C dark period. Continuous 5°C applied during both light and dark periods encouraged greatest cold tolerance. Deacclimation from the cold tolerant state was accelerated by both higher temperature and longer photoperiods, but temperature was predominantly the more significant factor. Application of short days combined with low temperatures significantly delayed deacclimation. But even in this environment cold tolerance decreased over time, possibly through the action of endogenous annual rhythms. Cold tolerance changed with calendar time even when external environmental conditions were maintained at constant values and plant morphology was apparently unchanged.     

菊花抗白色锈病相关基因CmDREBa-2的克隆及表达分析

以菊花（Chrysanthemum morifolium）免疫白色锈病品种‘C029’为试验材料,基于白色锈病病原菌诱导的菊花转录组数据库,采用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法克隆得到菊花DREB（Dehydration responsive element binding protein）基因,命名为CmDREBa-2。对其进行生物信息学分析和表达分析,结果表明：CmDREBa-2开放阅读框（ORF）全长291 bp,编码96个氨基酸;预测CmDREBa-2蛋白相对分子质量为11 159.04,pI为11.34,是一个定位于细胞核、亲水的不稳定蛋白;氨基酸序列和结构分析显示该蛋白含有1个由49个氨基酸残基组成的AP2保守结构域,所以该蛋白属于AP2/EREBP家族;进化树分析表明CmDREBa-2属于DREB家族的A-1组,CmDREBa-2蛋白与菊花的其他两个DREB类蛋白CmDREBa和CmDREBb的同源性较高;菊花‘C029’接种白色锈病病原菌6 h后,CmDREBa-2表达量达到最高,约为未接菌对照的34倍;用水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和乙烯利（ETH）处理‘C029’菊花叶片,结果表明CmDREBa-2受3种激素的诱导表达。