秦巴蛹虫草原生质体的制备及再生条件研究

【目的】研究秦巴蛹虫草原生质体制备及再生的最适条件,建立高效制备和再生原生质体的方法。【方法】以秦巴蛹虫草无性型菌株CM-16为材料,研究细胞壁裂解酶种类、酶解时间、酶解温度、菌丝体菌龄及稳渗剂种类对原生质体制备及再生效果的影响,并在单因素试验结果基础上进行正交优化试验。【结果】(1)以0.6mol/L NaCl为稳渗剂,用混合酶(质量分数1%纤维素酶和质量分数0.5%蜗牛酶按1∶1体积比混合)在(26±1)℃对菌龄6d的菌丝酶解3h,原生质体的产量最高。(2)以0.6mol/L甘露醇为稳渗剂,用混合酶(质量分数1%纤维素酶和质量分数0.5%蜗牛酶按1∶1体积比混合)在(26±1)℃对菌龄5d的菌丝酶解2h,原生质体的再生率最高;验证试验结果表明,在此条件下,原生质体再生率平均为25.7%,此时原生质体平均产量为83.42×105 mL-1。【结论】对酶解温度、酶解时间、菌丝体菌龄、稳渗剂及酶系种类等条件的优化,可提高秦巴蛹虫草原生质体的产量及再生率。     

蛹虫草原生质体的制备和再生研究

研究了不同渗透压稳定剂、酶的种类及浓度、温度、pH、β-巯基乙醇预处理等条件对蛹虫草原生质体制备的影响,以及不同培养基对原生质体再生的影响。结果显示蛹虫草菌株原生质体的最佳制备和再生条件为:0.7 mol/L氯化钠作为渗透压稳定剂,纤维素酶5 mg/dL、蜗牛酶5 mg/dL、溶菌酶5 mg/dL、溶壁酶10μL混合酶解6 h,酶解温度为30℃,最佳pH 5,再生培养基为PDA(添加0.7 mol/L氯化钠)。     

蛹虫草原生质体的制备与再生

为了建立原生质体介导的蛹虫草遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对蛹虫草原生质体形成和再生的影响.蛹虫革菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为:1%Cellulase,30℃作用2 h;最适渗透压稳定剂是0.8mol·L-1MgSO4;最适合原生质体再生的培养基为含0.6mol·L-1蔗糖的PDA培养基.原生质体液涂布双层再生培养基的方法再生率最高,为4.38%.     

蛹虫草培养基中虫草素分离提取的工艺综述

查阅了相关文献,对蛹虫草的化学成分及其药理作用、蛹虫草培养基的配制及蛹虫草的栽培作了简介。对虫草素的物化性质及生理活性作了详细综述,并对虫草素分离提纯在国内外研究动态进行了介绍,从而为从蛹虫草培养基中分离虫草素的新工艺提供了分析资料。     

蛹虫草超氧化物歧化酶的分离纯化及性质研究

以蛹虫草为材料,经过硫酸铵盐析、SephedexG!75柱层析和DEAE!52柱层析,得到纯化的超氧化物歧化酶(SOD),经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白区带,此酶比活力为17855.73U/mg,纯化倍数为53.7,回收率为21.8%。该酶在40℃保温150min,活性不变;在pH值5.0～9.0有较好的稳定性。该酶每亚基含1原子铁,对H2O2和乙醇-氯仿溶液敏感。     

人工蛹虫草固体培养基虫草素的分离纯化研究

以人工蛹虫草固体培养基为原料,首先热水浸提虫草素,然后设计单因素试验和正交试验,通过离子交换层析进行分离。结果表明:洗脱流速、料水比为主要影响因子。最优条件为:料水比1∶16,洗脱流速为30滴/min,离子柱pH 3.5,此时虫草素的得率为0.014 2%。     

大孔树脂分离纯化蛹虫草中虫草素工艺研究

考查了7种大孔吸附树脂对蛹虫草中虫草素进行吸附纯化效果,以高效液相色谱(HPLC)法测定样液中虫草素含量,筛选出适宜的树脂AB-8,研究了pH值等因素对该树脂静态吸附的影响,以及洗脱剂甲醇体积分数对静态解吸效果的影响,同时还研究了虫草素的动态吸附与解吸曲线。结果表明,AB-8树脂对蛹虫草中虫草素有良好的吸附纯化性能。当上样液pH值为5.0、吸附温度20℃、吸附液质量浓度为0.15 mg.mL-1、上样液量为10倍树脂柱体积及吸附流速为1.8 BV.h-1时,吸附效果最好。洗脱工艺条件为2.5倍树脂柱体积的15%甲醇。     

枣树原生质体分离条件的研究

枣树原生质体分离研究是其原生质体培养与融合、外源遗传物质转化等研究的基础工作。用胚性悬浮培养细胞、细粒状胚性愈伤组织、未细切愈伤组织和已细切愈伤组织等４种材料进行原生质体分离。结果表明,枣树胚性悬浮培养细胞是最佳起邕材料,用浓度为１０ｇ／Ｌ纤维素酶＋１ｇ／Ｌ离析酶＋ＣＰＷ盐（１３２０ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ和１００ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ组成的混合液）＋０．７ｍｏｌ／Ｌ甘露醇组成的混合     

冬虫夏草及蛹虫草寄主昆虫资源

1 冬虫夏草寄主昆虫 共1目1科23种鳞翅目蝙蝠蛾科23种.虫草蝙蝠蛾( Hepialuearmoricanus Dberthus. );康定蝠蛾(H. kangdingensisChu et Wang. );玉树蝠蛾(H. yushuensis Chu etWang. );斜脉蝠蛾(H. oblifurcus Cha et Wang. );门源蝠蛾(H. menynuanicus Chu et Wang. );四川蝠蛾(H. sichuanus Chu et Wang. );康姬蝠蛾(H. kangdingroides Chu et Wang. );云龙蝠蛾( H. yunlongensisChu et Wang. );丽江蝠蛾( H. lijiangensis Chu et樟木蝠蛾(H. zhangmeoensis Chu etWang.);     

微波-超声波协同作用蛹虫草虫草素提取条件的优化

为满足市场对虫草素的需求,提高虫草素提取率,选用蛹虫草为原料,在微波-超声波仪协同作用条件下进行该试验。通过单因素试验和正交试验考察料液比、溶剂比、提取时间和微波功率对蛹虫草虫草素提取率的影响。结果表明:蛹虫草虫草素提取的最佳提取条件为料液比1∶5,甲苯与无水乙醇配比10∶1,提取时间50min,微波功率为60 W,该条件下蛹虫草中虫草素的提取率为0.27%。     

石斛兰叶片原生质体分离条件研究

[目的]探讨了石斛兰原生质体分离过程中的影响因素,建立最佳的原生质体制备体系。[方法]以石斛兰叶片为材料,采用正交设计研究纤维素酶浓度、酶解时间、温度、pH值以及甘露醇浓度对石斛兰原生质体分离的影响。[结果]以3%纤维素酶R-10＋0.6%果胶酶Y-23为混合酶液,0.5mol/L甘露醇为渗透压稳定剂,在26℃的黑暗条件下,pH值为5.4的酶液组合中,黑暗条件下振荡,酶解15h,获得的原生质体产量最高。[结论]该制备体系为后续原生质体培养和体细胞杂交奠定良好的基础。     

芦荟原生质体的分离

[目的]为进一步的离体培养快速繁殖奠定基础,同时也为原生质体的融合(体细胞杂交)提供条件。[方法]采用酶解的方法以芦荟的叶片为材料进行原生质体分离。[结果]用芦荟的叶肉细胞可成功分离出原生质体,而且活力较高,可达90%以上。[结论]芦荟原生质体的成功分离主要取决于材料的来源、酶液的组成。另外还受酶解液的渗透压、温度和pH值影响。     

二倍体马铃薯原生质体的游离与培养

以3种不同基因型的二倍体马铃薯为材料，研究了材料来源和不同预处理及游离过程中渗透浓度对原生质体游离质量和后期发育的影响。结果表明，不同基因型二倍体马铃薯细胞酶解时的适宜渗透浓度不同，Dd-Ⅲ-5为0．35～O．40mol／L，JK3为0．35mol／L，而Dd-Ⅱ-10的适宜渗透浓度范围较广，在0．30～O．45m01／L内均可；不同预处理所游离的原生质体质量及后期发育存在差异，经预处理后的原生质体活性均高于85％，且分化能力强；同一基因型的叶肉和愈伤组织所游离的原生质体活性差异不大，在产量上叶肉细胞高于愈伤组织；愈伤组织分化时，分化培养基附加的3个激素组合中，NAA1mg／L＋ZT 0．2mg／L时愈伤组织全部褐化死亡，而NAA1mg／L＋2，4-D1mg／L＋GA3 0．2mg／L和NAA1mg／L＋BA1mg／L上的愈伤都分化，后者分化较早；基因型对原生质体后期发育影响较大，经培养后，仅Dd-Ⅲ-5得到完整植株。     

蕙兰原生质体分离条件的研究

用蕙兰无菌苗的幼叶和幼原球茎以及花蕾时的花瓣和花粉块为材料，研究了纤维素酶（商品名ＯｎｏｚｕｋａＲ－１０）浓度、渗透压稳定剂甘露醇浓度和酶解时间等因素对蕙兰原生质体分离的影响，结果表明：①花粉块和花瓣的分离条件为１．５％纤维素酶、０．３％果胶酶、１１％甘露醇、酶解时间６．５ｈ时，其原生质体最高得率分别为４．５６×１０６和２．１２×１０６个／ｇＦＷ。②幼叶的分离条件为１．０％纤维素酶、０．３％果胶酶、１３％甘露醇、酶解时间２０ｈ时，其原生质体最高得率为３．３６×１０６个／ｇＦＷ。③幼原球茎的分离条件为１．０％纤维素酶、０．３％果胶酶、１１％甘露醇、酶解时间１６ｈ时，其原生质体最高得率为１．８７×１０５个／ｇＦＷ。此外，花粉块与叶片的原生质体溶液中杂质很少，有利于提纯；花瓣原生质体溶液中碎屑较多，且有少量的针晶；原球茎原生质体溶液中的淀粉粒与针晶很多，非常不易提纯。因此，花粉块与叶片为蕙兰原生质体分离的较好材料     

红酵母原生质体制备和再生条件研究

［目的］初步探讨红酵母原生质体制备和再生的条件。［方法］以红酵母为试材,研究渗透压稳定剂pH值、酶浓度、酶解时间、预处理时间4个因素对红酵母原生质体制备率和再生率的影响。［结果］pH值在6.5～7.0,原生质体的制备率和再生率随着渗透压稳定剂pH值的升高而上升。当酶浓度从0.2%上升到1.0%时,原生质体制备率上升较快,而原生质体再生率下降较慢。随着酶解时间的增加,原生质体的制备率逐渐增加,而原生质体的再生率逐渐下降。在5～15 min,原生质体制备率和再生率均随着预处理的时间的增加而降低。［结论］当渗透压稳定剂pH值为7.0,蜗牛酶酶浓度为1.0%,酶解时间为60 min,预处理时间为5 min时,原生质体的制备率和再生率能分别达到较高的值。     

绿色木霉原生质体形成条件的研究

研究了绿色木霉F264(Trichoderma viride pers)的原生质体形成条件。结果表明,制备原生质体的最佳条件为:菌丝菌龄为18～20h,用溶菌酶:蜗牛酶=3∶3(mg/ml)的混合酶,以0.6 mol/LNaCl渗透压稳定剂的磷酸缓冲系统最好,在32℃酶解3h,原生质体产量最为理想。     

玉蕈原生质体制备条件研究

[目的]探索了玉蕈原生质体的制备与再生的适宜条件。[方法]采用斜面、平板培养基和液体培养基,研究了玉蕈菌丝体酶解时间(1~5 h)、酶解温度(25℃)和菌龄(4~7 d)以及渗稳剂种类(甘露醇、蔗糖、KCl、MgSO4)对玉蕈原生质体制备与再生的影响,优化了玉蕈原生质体制备与再生的条件。[结果]玉蕈原生质体制备与再生的适宜条件是:渗稳剂为0.6 mol/L MgSO4.7H2O,玉蕈菌丝体酶解时间2h,酶解温度25℃,菌龄5 d。在此条件下,玉蕈原生质体的产量最高,达16.7×106个/ml。[结论]该研究为利用原生质体技术进行玉蕈育种奠定了基础。     

植物原生质体研究概况

植物原生质体分离、培养及植株再生技术是进行植物育种、基因工程、遗传理论及细胞生理生化特性研究的平台,具有重要的研究意义。该研究对影响原生质体分离和培养的重要因素包括酶、酶解时间、渗透压稳定剂和培养方法等进行了综述,同时提出植物原生质体再生植株遗传性状稳定性、变异规律等问题,为今后植物原生质体分离和培养研究提供借鉴。     

芦荟原生质体融合的研究

以芦荟叶片为试材,采用酶解方法进行原生质体分离,并在此基础上对斑纹芦荟和不夜城芦荟进行原生质体融合。结果表明,以芦荟的叶肉细胞为试材,可成功分离出原生质体,而且活力较高,达90%以上。聚乙二醇（PEG）融合的结果可获得部分融合体。芦荟原生质体的成功分离主要取决于材料的来源、酶液的组成,另外还受酶解液的渗透压、温度和pH值等影响。融合的效率主要受融合剂的浓度、原生质体的生理状态及处理的时间等影响。     

紫罗兰下胚轴原生质体分离条件的研究*

 以紫罗兰（Matthiola incana）无菌苗下胚轴为材料，对光照条件、无菌苗日龄、酶液渗透压、酶液组合和酶解时间对其原生质体分离的影响进行了研究。结果表明，种子在20 ℃黑暗条件下萌发4 d后，转移到25 ℃，2 000 lx，14 h光照/日条件下约14日苗龄，用1.2%Celluase (Onozuka R-10)+0.8% Macerozyme(Onozuka R-10)+3 mmol/L MES+CPW-10 mol/L酶组合处理约12 h，可以高效分离出有活力的原生质体。这为有效从紫罗兰下胚轴原生质体再生植株和进行体细胞杂交奠定了基础。