可乐猪Ghrelin基因多态性及其对肉质性状的遗传效应分析

根据GenBank上的Ghrelin基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从可乐猪肌肉组织基因组中扩增出了包含Ghrelin基因全序列的特异片段,包括第一、第二外显子和第一内含子DNA序列,并进行直接测序,分析该基因与可乐猪12项肉质性状的关联性,结果表明：在Ghrelin基因第一内含子上检测到1个单碱基突变：G252A,表现出纯合型GG和杂合型GA两种基因型,其中GG基因型频率高于GA基因型频率,达65.4%,等位基因G为优势等位基因,表现为低度多态。χ2检验表明,该SNP位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P﹥0.05)。最小二乘分析显示,Ghrenlin基因252位点对可乐猪的肉质性状无显著影响(P>0.05)。     

家蚕BmNaPi2基因的克隆与转录活性检测

本文通过生物信息学分析和分子生物学实验获得了家蚕钠离子依赖性的磷酸盐转运蛋白的同源基因BmNaPi2。该基因长1 336 bp（GenBank登录号：HM593516）,含5个外显子,位于家蚕第3号染色体,编码区长1 314 bp,基因编码437个氨基酸,预测蛋白序列有10个疏水的跨膜结构域,与果蝇、疟蚊、埃及伊蚊、致倦库蚊、赤拟谷道等的同源蛋白的相似性约57%。RT-PCR检测基因在5龄3天家蚕幼虫9种组织中的血液、马氏管和体壁中表达,而中肠、丝腺、生殖腺、头和脂肪体中没有表达。     

猪TOLL样受体7全基因的扩增、克隆及生物信息学分析

根据猪Toll样受体7基因(TLR7)序列设计、合成1对引物,直接从三元猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增三元猪TLR7全基因,并进行克隆和测序.测序结果表明,获得了三元猪TLR7全基因序列,其大小为3 160 bp,包含一个完整阅读框(3 153 bp),编码1 051个氨基酸残基,有15个潜在的N-糖基化位点和4个潜在的磷酸化位点,信号肽切割部位位于第29～30位氨基酸之间,跨膜基因序列为第844～866位.TLR7基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.三元猪TLR7基因的成功克隆为进一步研究猪TLR7基因表达、生物学功能、揭示ssRNA病毒入侵宿主的致病机制以及猪抗病毒免疫及育种的相关研究奠定了基础.     

玉米ZmCKX基因的克隆及分析

细胞分裂素氧化酶降解细胞分裂素,从而调控植物的生长发育,克隆和分析玉米细胞分裂素氧化酶基因(ZmCKX),为研究ZmCKX在玉米抗逆反应中的作用奠定基础。运用RT-PCR和RACE技术克隆了ZmCKX基因的cDNA全长,并对其进行了初步的生物信息学分析。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果表明,PCR扩增出一条约1035bp的片段,与目的片段大小相似。将目的片段与pMD-19t构建的pMDZmCKX重组质粒并转化为DH5α,经检测片段与原始片段大小相同。Blastn分析结果表明,其与ZmCKX1的相似性为99%。对该基因序列分析表明,ZmCKX基因编码的蛋白的开放阅读框为1035bp,起始位点为23bp,终止位点为1057bp。ZmCKX基因长1035bp,编码344个氨基酸。它与ZmCKX1基因核苷酸同源性99%。ZmCKX基因编码的蛋白是存在于细胞质中的亲水蛋白。     

青稞hblt14．2基因的克隆及功能分析

根据大麦blt14.2基因序列设计引物,用青稞基因组DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列,命名为hblt14.2,在GenBank登录号为EF514912.该基因含470 bp,包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5'非翻译区和152 bp的3'非翻译区,编码82个氨基酸残基,富含G1y、A1a、Leu和Va1,与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性.与大麦bit14.2基因具98.9%同源性,所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别.将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中,构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt,通过农杆菌介导转化烟草,并对转基冈烟草进行抗寒性检测.结果表明,青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系.     

鸡IL-2基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

根据GenBank中已发表的鸡白细胞介素2 (IL-2)mRNA基因序列,利用Premier 5.0软件设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术,以ConA刺激的鸡外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出鸡IL-2基因。经琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段约为432 bp,分离纯化片段,克隆入pMD-18T载体,转化DH5α感受态细胞,获得阳性重组质粒,经酶切鉴定,测序结果显示,我们得到了长432bp的基因,含有一个 432bp的开放阅读框,编码143个氨基酸。生物软件分析结果表明该序列与GenBank中发表的鸡的IL-2的核苷酸序列同源性为98.8%,与黄牛、马、鸡、绵羊、牛、犬、人、山羊、鼠、水牛的核苷酸同源性分别为31.2%、28.2%、27.3%、30.6%、26.2%、31.7%、30.1%、30.8%、26.6%、30.6%。与GenBank中发表的鸡IL-2编码的氨基酸序列同源性为95.8%,与上述动物的氨基酸序列同源性分别为7.6%、7.6%、9.7%、7.6%、6.9%、10.4%、11.8%、7.6%、9.0%、7.6%、10.4% 。这表明鸡的IL-2基因被成功克隆,它存在着种属特异性。这为进一步研究该基因的生物学作用特别是利用IL-2增强DNA疫苗的免疫效果奠定了基础。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素-C基因的克隆与序列分析

摘 要：从长白猪肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR技术扩增pMBL-C基因,与pMD18-T载体连接,获得pMBL-C基因。序列测定结果显示该基因编码区为723bp,编码241个氨基酸残基。与已发表的猪MBL-C具有99%同源性;进化树分析显示与哺乳动物的MBL-C基因,尤其是牛的亲缘关系最近,而与MBL-A基因相差较大,与禽类的最远。本研究为进一步研究猪MBL分子的遗传特征提供了依据。     

香蕉枯萎病菌果胶裂解酶基因的克隆与序列分析

为了解香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)4号生理小种(FOC4)PL基因序列特征,根据同源物种PL相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术,克隆了FOC4序列基因,命名为pl2-FOC4。PL基因DNA序列由3个内含子和4个外显子组成。其cDNA编码区包含了831 bp的片段,编码276个氨基酸。预测编码蛋白有信号肽,其分子质量和等电点分为30271.9 Da和5.06,该蛋白为稳定存在的蛋白。PL2-FOC4具有5个N-糖基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个豆蔻酸位点。该基因编码的蛋白具有一定保守性,进化上与镰刀菌亲缘关系最近。     

蝴蝶兰一个C3型PEPC基因的克隆及其低温胁迫下的表达分析

为研究蝴蝶兰对低温胁迫响应的分子调控机理,本研究采用RT-PCR及RACE的方法从蝴蝶兰叶片中克隆了一个C3型PEPC基因PhPEPC (登录号为:MK482383),该基因cDNA全长序列为3 448 bp,开放阅读框长度为2 898 bp,编码965个氨基酸;该蛋白包含一个PEPC酶结构域,具有2个PEPCase活性位点,86个磷酸化位点和7种motifs,为一酸性亲水性蛋白。系统进化分析显示,蝴蝶兰PhPEPC蛋白与兰科植物小兰屿蝴蝶兰、铁皮石斛、深圳拟兰等的PEPC蛋白亲缘关系最近。分析表明,PhPEPC基因在蝴蝶兰根中表达水平最高,在花器官中的表达水平次之,在叶和花梗中的表达水平最低;在13℃/8℃的昼/夜温度条件下,PhPEPC基因的表达水平先升高后降低,当恢复培养3 d时,该基因的表达水平又趋于升高。结果表明,蝴蝶兰PhPEPC基因参与了对低温胁迫的调控。本研究结果将有助于理解蝴蝶兰对低温胁迫的适应机制,并为蝴蝶兰新品种的遗传改良提供依据。     

青稞hblt4.2基因的克隆及功能分析

根­据大麦blt14.2基因序列设计引物, 用青稞的DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列, 命名为hblt14.2, 在GenBank登录号为EF514912。该基因含470 bp, 包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5''非翻译区和152 bp的3''非翻译区, 编码82个氨基酸残基, 富含Gly、Ala、Leu和Val氨基酸, 与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性。与大麦blt14.2基因具98.9%同源性, 所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别。将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中, 构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt, 通过农杆菌介导转化烟草, 并对转基因烟草进行抗寒性检测。结果表明, 青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系。     

梨几丁质酶基因克隆及其生物信息学分析

对克隆获得的梨几丁质酶基因Lchi1进行生物信息学分析,从而为该基因的功能鉴定提供理论基础,以期为梨的抗病育种提供基因来源。根据Genbank中已克隆得到的几丁质酶基因保守区,在梨基因组数据库中进行Blast比对,调取DNA序列,从而设计引物,以高抗腐烂病品种‘小香水’(Pyrus ussuriensis cv. Xiaoxiangshui)为研究材料,克隆获得梨几丁质酶Lchi1基因cDNA全长,并对其进行初步的生物信息学分析。梨基因组数据库中调取的DNA序列2535 bp,含有3个外显子区、2个内含子区。Lchi1基因全长1300 bp,编码322个氨基酸,其蛋白的分子式为C1607H2407N415O468S17,分子量为35573.3 Da,理论等电点为7.10。二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构具有高度保守性。Lchi1编码蛋白为可溶性胞外蛋白,存在少量的潜在磷酸化位点,属于糖苷水解酶19家族,含有N-端信号肽,但是缺乏几丁质结合区。Lchi1基因属于CLASSⅡ几丁质酶基因,与其它科属植物的几丁质酶基因相似性均较高。     

转基因抗虫棉外源DNA插入整合结构分析和转化事件特异性检测方法的建立

通过3’端2次高效热不对称交互PCR(hiTAIL-PCR)和5’端4次hiTAIL-PCR及1次长链PCR获得了转基因抗虫棉材料06N-119的外源DNA插入片段的全序列。外源DNA插入片段全长11578bp,由NptⅡ基因和Bt基因两个表达盒串联构成。插入位点处缺失75个碱基,未发生基因重组现象。根据3’端旁侧序列设计引物,特异性和灵敏度检测结果表明,建立的3’端定性PCR检测方法特异性强,灵敏度高,最低检测限为每100ng模板量的0.05%,相当于11个靶标序列拷贝。本研究结果对转基因抗虫棉外源基因检测和生物安全评价具有重要意义。     

牡丹类psDHN-YSK2基因全长cDNA的克隆与表达分析

为了获得牡丹类脱水素基因的全长cDNA序列,推测其在休眠解除进程中的生物学功能,以不同低温处理时间的牡丹花芽为供试材料,末端快速扩增方法克隆全长cDNA序列,实时定量PCR分析其表达模式。结果表明牡丹类脱水素基因全长cDNA序列为1187 bp,包括831 bp的开放阅读框,114 bp的5’非编码区和242 bp的3’非编码区。其编码的蛋白具有两个植物脱水素蛋白特征性K片段,根据Close的分类方法,属于YSK2类脱水素蛋白。系统发生分析表明psDHN-YSK2基因与葡萄亲缘关系最近。在花芽内休眠解除前期随着低温处理时间的延长psDHN-YSK2表达呈上调趋势。本研究克隆了牡丹psDHN-YSK2的全长cDNA序列,分析了其在花芽内休眠解除过程的表达趋势,暗示了其参与了牡丹花芽的内休眠过程。     

苎麻Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析

以耐旱性较强的湘苎3号为材料,从苎麻转录组测序结果中获得了1个与P5CS基因高度相似的Unigene,该片段长1 448 bp,根据该序列设计5′RACE和3′RACE槽式PCR引物,利用RACE结合RT-PCR技术分别克隆得到590 bp的5′端和293 bp的3′端,拼接获得该基因全长cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析表明,该基因全长为2 318 bp,其中开放读码框为2 154 bp,编码717个氨基酸,其编码蛋白质的等电点和分子量分别为6.57 kD和77.56 kD,与亚洲棉、麻风树、拟南芥和水稻的P5CS基因的核苷酸序列相似性分别为81%、81%、75%和72%,蛋白质序列的相似性分别为86%、85%、78%和77%,说明该基因与P5CS为同源,被命名为BnP5CS1。半定量RT-PCR分析表明,该基因在苎麻的茎尖中表达量最高,在根中其次, 且受干旱胁迫的诱导。P5CS基因是植物体内合成脯氨酸的关键酶基因,BnP5CS1基因的克隆将为苎麻的抗逆分子育种和进一步的功能分析鉴定基础。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及低温下的表达分析

根据棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)基因已知EST序列设计引物,采用RACE和RT-PCR技术克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为GhSAMDC (GenBank登录号为JN020148)。生物信息学分析表明,GhSAMDCcDNA序列全长1 874 bp,涵盖tiny ORF (tORF)、upstream ORF (uORF)和main ORF (mORF) 3个植物SAMDC基因特征ORF。其中mORF长1 064 bp,编码含355个氨基酸残基的SAMDC酶原,预测分子量为38.25 kD,该酶原含有高度保守的酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和与SAMDC蛋白快速降解有关的PEST (TIHVTPEDGFSYAS)结构域。GhSAMDC基因组DNA序列全长2 743 bp,包含3个内含子,均位于5'' UTR,其中一个位于uORF内。聚类分析表明,GhSAMDC与葡萄中该蛋白的同源关系最近,并且与其他双子叶植物聚为一类。荧光定量PCR分析结果表明,GhSAMDC表达受低温诱导,在冷敏感品种新陆早1号中基因表达水平明显高于在耐冷品种新陆早33号中。     

木薯低温诱导基因MeLTI6A的克隆与序列分析

为了研究木薯(Manihot esculenta Crantz)的抗逆境胁迫机制,从水稻低温诱导及抗旱基因OsLTI6A出发,同源克隆了木薯的抗逆基因MeLIT6A,并对其序列和功能进行了分析研究。MeLIT6A的基因组序列全长为273 bp,其中ORF长度为173 bp,内含子长度为99 bp;编码1个含有57个氨基酸残基的蛋白,含有1个与Pmp3超级家族同源性极高的保守区域。该基因推导蛋白MELTI6A与蓖麻的、拟南芥的、水稻的、玉米的低温诱导蛋白基因6A (LTI6A)的推导蛋白的同源性分别为：89.7%。81.0%、74.1%和87.9%。蛋白功能分类预测MELTI6A是1个非酶类的、疏水性较高的、有2个透膜区域的蛋白,可能有转运蛋白和作为受体蛋白的功能,与拟南芥的AtLTI6A的功能相似。     

百合花青素苷合成酶基因片段的克隆及表达分析

为了克隆百合花青素苷合成酶基因(anthocyanidin synthase, ANS),通过已报道的其他物种的ANS基因保守序列设计简并引物,采用同源克隆的方法成功克隆得到了百合ANS基因片段,该片段长701 bp,编码233个氨基酸残基。根据蛋白比对结果,百合ANS基因编码的氨基酸序列与郁金香、荷兰鸢尾、甜樱桃的一致性分别为86%、81%、77%。采用半定量RT-PCR法分析表明,该基因在百合花瓣中的表达水平最高,叶和茎次之,鳞茎中不表达。本研究从百合中分离得到了ANS基因片段,为后续获得基因全长打下了基础。     

棉花转录因子基因GhMYB的克隆及特征分析

从棉花中克隆了1个MYB基因,命名为GhMYB(Gen Bank No.HQ234875)。该基因c DNA全长1264bp,具有1个774 bp的开放阅读框,5'非编码区为250 bp,3'非编码区为240 bp,编码256个氨基酸,预测分子量约为28.867 k Da,等电点为8.56,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB基因组序列长度为1355 bp,包含2个外显子和1个内含子。氨基酸同源分析发现,GhMYB与来自可可、陆地棉和巴旦木的MYB同源性较高。亚细胞定位结果表明,GhMYB:GFP融合蛋白定位于细胞核中。SDS-PAGE电泳分析表明,p ET-28a-GhMYB最佳诱导表达条件为1.0 mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导4 h。电子表达谱分析表明,GhMYB基因在棉铃中特异表达,在根和叶中受水涝胁迫的诱导表达。     

甘蓝KAPP编码基因的克隆与序列分析

采用PCR、RT-PCR及其他分子生物学方法,以甘蓝基因组DNA、花蕾RNA和叶片RNA为模板,分别对甘蓝KAPP gDNA和KAPP cDNA进行扩增,分别获得3247bp的KAPP gDNA片段、1699bp的KAPP cDNA片段、1578bp的花蕾KAPP2 cDNA片段和1581bp的叶片KAPP2cDNA片段。对克隆的甘蓝KAPP gDNA和cDNA(结合报道的KAPPcDNA)进行比对表明,甘蓝KAPP基因包含11个内含子,均符合"GU-AG"剪接规则,并且克隆得到的KAPP cDNA序列与报道的KAPP cDNA序列有6处单个碱基的差异,但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾KAPP2 cDNA、叶片KAPP2 cDNA片段与报道的KAPP cDNA序列相似性分别为85.2%和85.0%。这两个序列分别在590bp和593bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明,两基因编码的氨基酸序列与拟南芥KAPP氨基酸序列相似性最高,其次为甘蓝KAPP氨基酸序列。以已报道的8种植物KAPP的CDS及本实验所克隆的两个KAPP2序列构建分子进化树,获得序列与甘蓝KAPP序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树,推测KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝,而笔者克隆到的KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝,是KAPP进化过程中突变失活的拟基因。     

蒙古马肌生成抑制基因(MSTN)的克隆及序列分析

肌生成抑制基因(MSTN)在发育和成熟的骨骼肌中特异表达,并对肌肉发育和再生具有负调控作用。依据马肌生成抑制素(MSTN)编码序列设计引物,以蒙古马基因组DNA为模板,利用PCR技术,扩增出MSTN基因的几个片段后,测序并按顺序拼接,得到DNA全序列。序列分析结果表明,MSTN基因由2个内含子和3个外显子组成,碱基数量分别为第一外显子373 bp、第二外显子374 bp、第三外显子381 bp;第一内含子1 833 bp、第二内含子2 018 bp,共有4 979个碱基。该序列首次登录到GenBank,登录号为AY840554。