细粒棘球绦虫EgM123基因重组狂犬病病毒SRV9株基因组全长cDNA的构建

试验旨在通过反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV₉疫苗株,为中国农牧区的狂犬病和包虫病的有效防控提供技术手段。本试验参照狂犬病病毒SRV₉株全基因组序列,利用基因合成技术分别合成狂犬病病毒的结构蛋白N、P、L基因,以及N-P-M基因融合片段和狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因与增强型绿色荧光蛋白eGFP融合片段基因,通过载体酶切插入连接方法,依次将狂犬病病毒L基因、N-P-M基因融合片段和G+EgM123+eGFP基因融合片段重组于pcDNA3.1（-）表达载体上,构建EgM123基因重组狂犬病病毒SRV₉全长cDNA。将合成的基因分别构建于pcDNA3.1（-）表达载体,经转化、质粒酶切、基因测序鉴定结果表明,狂犬病病毒N、P、L、N+P+M和G+EgM123+eGFP基因片段长度分别为1 365、1 107、6 471、3 160和3 256 bp;EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段长度为12 465 bp,各基因片段测序结果为100%。本试验成功构建了EgM123基因重组狂犬病病毒全长cDNA片段和狂犬病病毒N、P、L基因的真核表达载体,为通过反向遗传学拯救EgM123基因重组狂犬病病毒及狂犬病和包虫病二联基因重组口服活疫苗的研制提供参考。     

区分猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株和野毒株的gE-PCR方法的建立

根据编码猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地从猪伪狂犬病病毒感染的细胞中扩增出预期的178bp片段,而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒gE基因缺失株均未扩增出相应的片段,经PCR扩增产物测序鉴定,证实了该扩增片段为预期目的片段;敏感性试验表明,该体系可检测到102TCID50的猪伪狂犬病病毒。本方法的建立能够区分基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪,使猪伪狂犬病病毒的检测更为快速、准确。     

山羊痘病毒ITR基因片段的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y和B株ITR基因片段,插入pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,提取重组载体经PCR和酶切鉴定后测序,并与GenBank上8株羊痘病毒相应序列进行同源性分析。结果经PCR扩增,4株病毒均可得到一条均一的DNA片段,该片段可被内切酶AluⅠ特异酶切,而且该PCR的DNA模板最小检出量为24.40pg。经测序,该基因片段长度为289bp;序列比较发现,4株病毒ITR片段与GenBank上2株山羊痘病毒的核苷酸与氨基酸序列同源性均为100%,与3株绵羊痘病毒分别为98.2%和96.5%,与3株牛疙瘩皮肤病病毒为98.2%～99.3%和96.5%～97.7%。这表明ITR基因片段在羊痘病毒属中较为保守,可以针对ITR基因建立羊痘病毒的PCR检测方法。     

区分猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株和野毒株的gE—PCR方法的建立

根据编码猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地从猪伪狂犬病病毒感染的细胞中扩增出预期的178bp片段,而猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒gE基因缺失株均未扩增出相应的片段,经PCR扩增产物测序鉴定,证实了该扩增片段为预期目的片段;敏感性试验表明,该体系可检测到10^2TCID50的猪伪狂犬病病毒。本方法的建立能够区分基因缺失疫苗免疫猪和野毒感染猪,使猪伪狂犬病病毒的检测更为快速、准确。     

多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因

根据对已报道的PCR检测方法灵敏性评价,以常用KHV病毒PCR检测的目的基因KHVSphI片段(AY568590)、KHV5/9(AF411803)和KHVTK基因(AJ535112)作为靶基因,设计并选择3对特异性引物建立的多重PCR检测体系用于KHV病毒多基因的检测。本研究建立的多重PCR体系具有较高的特异性,能够特异性扩增出KHVSphI片段290bp、KHV5/9片段484bp和KHVTK基因片段409bp,对锦鲤和鲤鱼的另外一种病毒性病原鲤春毒血症病毒检测结果为阴性。多重KHV病毒PCR体系检测KHVSphI、KHV5/9和KHVTK基因片段单一模板的检测下限分别为:10fg、100fg和100fg,在相同模板浓度的情况下,KHVSphI、KHV5/9和KHVTK基因片段同时被检出的检测下限为100fg。对KHV病毒感染组织的检测结果表明,多重KHV病毒PCR检测结果与常规PCR检测结果基本吻合,在多重PCR检测体系中KHVTK基因片段检测的灵敏度高于检验检疫行业标准方法。结果表明,多重KHV病毒PCR检测方法能够快速、准确和灵敏地检测KHV病毒基因。     

山东新城疫病毒分离株F基因的遗传进化分析

应用特异性引物从山东某发病鸡场病鸡体内分离到的命名为JN09的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)中扩增其F基因,预计扩增片段大小为1 700 bp. RT-PCR扩增出的目的片段大小与预计扩增片段大小相符合,测序结果表明扩增片段与新城疫病毒F基因序列相符.对其F基因进行遗传进化分析,并结合山东地区近几年来的分离毒株的相关信息,着重分析该地区近年来新城疫病毒 F基因的变异情况.     

犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救与鉴定

探究犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救及鉴定,为后期犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒活疫苗的研制奠定基础。采用脂质体转染的方法,将纯化后的重组质粒(pcDNA-N-G-EGFP-CDVN-PM-L)与辅助性表达质粒(pcDNAN、pcDNA-G、pcDNA-P、pcDNA-L)共转染BSR细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光技术进行检测并鉴定。结果显示,对盲传至第6代、第9代病毒液进行RT-PCR检测,均出现与预期相符的目的片段(狂犬病病毒N基因片段大小为1 315bp,犬瘟热病毒CDV-N基因片段大小为1 653bp)。间接免疫荧光试验后在激光共聚焦显微镜下,试验组均可观察到大量绿色荧光表达。RT-PCR结果与间接免疫荧光试验结果相吻合,表明犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒拯救成功。     

禽呼肠病毒S1基因编码蛋白合成机制研究进展

禽呼肠病毒是正呼肠病毒属的重要成员之一,能感染禽类,直接危害肉鸡、蛋鸡、幼龄火鸡和雏番鸭的生长发育,甚至引起死亡,从而导致严重的经济损失。近年来,人们对禽呼肠病毒分子生物学方面的研究已有不少进展,特别是关于禽呼肠病毒的S1基因编码蛋白的机制。禽呼肠病毒的基因组含有10个双链RNA基因片段,其中的9个基因片段均是以核糖体扫描翻译机制来合成对应的病毒蛋白。但S1基因片段的结构较为特殊,其RNA基因片段含有3个相互重叠的基因编码区,并利用不同的翻译机制分别合成3种蛋白,即非结构蛋白p10、p17和结构蛋白σC。这3种蛋白的主要作用分别是引起病毒感染的细胞与周围正常细胞之间的融合,促进病毒在细胞内的繁殖,帮助病毒吸附易感细胞表面的受体等。论文着重介绍禽呼肠病毒S1基因编码蛋白的相关合成机制。     

科技进展

转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立及抗猪瘟病毒转基因猪的构建构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病     

狐狸脑炎病毒的分离鉴定和流行病学调查

用狗肾传代细胞(MDCK)从3个养狐场的病死狐脏器中分得3株病毒,经电镜观察,理化学、生物学性状和血清学鉴定以及病毒结构蛋白分析,证明其为狐狸脑炎病毒。同时,对这3个发病狐场进行了流行病学调查,所获得的临床资料以及血清学、病毒学和细菌学检测结果进一步证实了这3个养狐场此次所发生的传染病是狐狸脑炎.     

犬瘟热弱毒株CDV3生物学特性鉴定

以SPF鸡胚成纤维细胞 (CEF)从国外引进的疫苗中分离到犬瘟热弱毒株CDV3 。对犬瘟热弱毒株CDV3 的理化特性 ,细胞病变规律 ,病毒毒价 ,核酸型、血清学交叉反应 ,试验动物的安全性及免疫原性等内容进行了试验 ,结果表明 ,犬瘟热弱毒株CDV3 可作为狐犬瘟热疫苗生产用毒种。     

狐狸脑炎病毒的分离鉴定

通过ＭＤＣＫ传细胞从黑龙江某狐场疑似狐狸脑炎病狐的肝脏中分离到对本动物具有较强致病能力的强毒株,定名为ＦＥＶ－Ｈ。经系统鉴定,并与已知国内分离毒株狐狸脑炎病毒ＦＥＶ－８８０１,狐喉气管炎病毒ＦＡＶ－２比较,证实为狐狸脑炎病毒,属犬１型腺病毒（ＣＡＶ－１）。     

犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育及致病性研究

为研究从北极狐病料样品中分离的一株强毒的致病性,本实验采用病例复制、RT-PCR检测、间接免疫荧光检测(IFA)和电镜观察等方法证实分离得到犬瘟热病毒(CDV),并命名为HBF-1。对该分离株H基因的核苷酸序列比对显示,HBF-1与疫苗株的同源性为91.0%～91.5%,与国内外分离株的同源性为93.5%～99.9%。病毒传代培育试验结果显示HBF-1已适应在北极狐、貉、水貂和犬体内繁殖,具有较广的感染范围。但各种动物的临床症状和剖检病理变化存在不同程度的差异,表明HBF-1分离株对北极狐、貉、水貂和犬的致病力不同;毒力测定结果显示其半数感染量分别为102.46 ID50/mL、102.95 ID50/mL、102.46 ID50/mL和102.58 ID50/mL,表明HBF-1为一株CDV强毒株,可以在不同的经济动物间进行水平传播。本研究结果为开发新的CDV疫苗提供了实验基础。     

Newly discovered viruses of flying foxes.

Flying foxes have been the focus of research into three newly described viruses from the order Mononegavirales, namely Hendra virus (HeV), Menangle virus and Australian Bat Lyssavirus (ABL). Early investigations indicate that flying foxes are the reservoir host for these viruses. In 1994, two outbreaks of a new zoonotic disease affecting horses and humans occurred in Queensland. The virus which was found to be responsible was called equine morbillivirus (EMV) and has since been renamed HeV. Investigation into the reservoir of HeV has produced evidence that antibodies capable of neutralising HeV have only been detected in flying foxes. Over 20% of flying foxes in eastern Australia have been identified as being seropositive. Additionally six species of flying foxes in Papua New Guinea have tested positive for antibodies to HeV. In 1996 a virus from the family Paramyxoviridae was isolated from the uterine fluid of a female flying fox. Sequencing of 10000 of the 18000 base pairs (bp) has shown that the sequence is identical to the HeV sequence. As part of investigations into HeV, a virus was isolated from a juvenile flying fox which presented with neurological signs in 1996. This virus was characterised as belonging to the family Rhabdoviridae, and was named ABL. Since then four flying fox species and one insectivorous species have tested positive for ABL. The third virus to be detected in flying foxes is Menangle virus, belonging to the family Paramyxoviridae. This virus was responsible for a zoonotic disease affecting pigs and humans in New South Wales in 1997. Antibodies capable of neutralising Menangle virus, were detected in flying foxes.     

梅花鹿狂犬病的病原学研究

应用鼠脑传代,从具有神经症状和后躯麻痹的鹿尸脑组织分离获得5株弹状病毒。对其中一株——8202株,从形态学、生物学和理化学等方面进行了鉴定。应用弹状病毒料中狂犬病海和狂犬相关病毒等的抗血清或免疫腹水,在小鼠体内进行交叉中和试验,证明鹿毒8202株同狂犬病毒固定毒(北京株)有密切的抗原联系。经WHO狂犬病咨询和研究协作中心应用42个单克隆抗体,以间接荧光抗体试验检测鼠脑压印片,证明该株病毒的核衣壳抗原结构与大多数陆栖哺乳动物狂犬病毒相同,但有别于欧洲狐狸的狂犬病毒;用40个抗糖蛋白单克隆抗体,通过血清中和试验,证明8202株同欧洲狐狸毒株很相似。将该毒复旧鹿体,并接种犬及其他动物,发现其对鹿的毒力很强,而对犬及其他家畜毒力较弱,甚至没有毒力。结论认为,鹿毒8202株是狂犬病毒适应于鹿体的变异株。     

狐犬瘟热继发细菌感染的诊断及防治

通过对一送检病狐临床症状的调查,剖检病变和细菌学检查,并进行RT-PCR检测犬瘟热病毒,确诊该狐为犬瘟热继发大肠杆菌感染,通过疫苗注射和治疗细菌感染,较好地控制了该病。     

狐狸流产奇异变形杆菌的分离鉴定及特征分析

为明确引起狐狸流产的主要原因,确定主要病原体并提出有效防控措施,试验收集了河北地区多个流产狐狸的脾脏和卵巢,利用细菌分离培养、形态观察、药敏试验、16S rRNA基因测序和序列分析及同源性比对等方法对引起狐狸流产的病原体进行分离鉴定,分析其耐药性,筛选有效治疗药物;同时对病原菌的致病力进行检测。结果显示,从流产狐狸病变的脾脏和卵巢中分离到了1株单一的革兰氏阴性菌,命名为FOX-abortion-Hebei。药敏试验结果显示,该菌对头孢哌酮等11类药物敏感,而对妥布霉素等5类抗菌药物中度敏感。动物试验结果显示,该菌株具有较强的致病性,攻毒小鼠和狐狸后均可引起动物死亡。16S rRNA测序和同源性分析结果显示,分离到的革兰氏阴性菌为奇异变形杆菌（Proteus mirabilis,PM）,与已公布序列的同源性为93.6%~99.9%;系统进化树结果显示,该菌与埃及分离到的菌株（AUMC B-199）亲缘关系最近。本研究明确了狐狸流产主要是由奇异变形杆菌感染所致,也是首次在流产狐狸中分离到该菌,且能引起严重的繁殖障碍,需在狐狸养殖中加以防控。     

不同宿主来源犬瘟热病毒的分离及致病相关基因序列分析

利用Vero-DST细胞从死亡犬、狐狸肺、脾内分离到4株犬瘟热病毒-CDV-TM-CC、CDV-Dog-SCh、CDV-Fox-SY、CDV-Fox-WF,在Vero-DST细胞上传5代没有细胞病变,5代细胞培养物经电镜、间接免疫荧光及PCR鉴定为阳性。与本实验室保存的CDV-Monkey-BJ进行基因测序,并对与致病相关的F蛋白、V蛋白进行分析,F蛋白分析5株毒具有6个潜在N-末端糖基化位点,与强毒株同源性在92%～99.7%,与疫苗株不高于93.3%,在F1亚基内有7个特有氨基酸位点,这可能与其对灵长类致病有关。V蛋白分析表明,其与强毒株同源性在94%～99.7%之间,而与疫苗株不高于93.3%,CDV-Monkey-BJ C272R突变使其Zn结合能力丧失。试验结果显示,所有分离株均为强毒株,不同宿主毒株序列存在差异,值得进一步研究。     

正呼肠孤病毒及其分类学依据研究进展

正呼肠孤病毒是由编码 10个片段的双链RNA (dsRNA)组成 ,没有囊膜。根据国际病毒分类委员会第七次报告 ,正呼肠孤病毒属共有 4个成员 ,分 3个亚群 :第一个亚群包括非融合基因哺乳动物正呼肠孤病毒 (MRV) ;第二个亚群为融合基因正呼肠孤病毒 ,包括禽呼肠孤病毒 (ARV)和从飞狐 (flyingfox)分离到的内尔森海湾病毒 (NelsonBay) (NBV) ;第三个亚群包括从狒狒体内分离到的呼肠孤病毒 (BRV)。从蛇分离到的两株呼肠孤病毒暂且将其归为第VI亚群