虾夷马粪海胆NLR家族基因片段的克隆及表达特征分析

采用同源克隆和半定量RT-PCR方法,对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius NLR家族基因片段进行了克隆和组织表达特征分析。将紫球海胆S. purpuratus的9组NLR家族聚类的编码区序列进行比对后,根据保守区域设计引物扩增虾夷马粪海胆中相应的基因,通过测序获得了9组不同NLR聚类基因片段,每组各10个测序结果,通过基因序列及氨基酸序列比对分析,发现存在长度及序列结果上的差异,这说明每组NLR家族聚类都存在多个家族成员。同时选取虾夷马粪海胆的不同组织提取RNA,反转录后使用同样的引物进行半定量RT-PCR分析,结果表明, NLR基因在虾夷马粪海胆的管足、肠、围口膜、体腔细胞、性腺中存在高效表达,且在围口膜及性腺中表达量最高,表明NLR基因在虾夷马粪海胆中普遍表达,并存在表达差异。研究表明, NLR基因在海胆免疫过程中起着重要作用。     

饲料脂肪水平对中间球海胆幼胆生长、消化酶和热胁迫后抗氧化酶活力的影响

为了确定中间球海胆Strongylocentrotus intermedius幼胆饲料中适宜的脂肪水平,采用摄食生长试验探讨了饲料中脂肪水平(3%、6%、9%、12%和15%)对海胆幼胆存活、生长、消化酶和热胁迫后抗氧化酶活力的影响,试验共进行96 d。结果表明:试验结束时,6%饲料脂肪水平组海胆增重率最高,显著高于15%脂肪组(P0.05);随着饲料脂肪水平的升高,中间球海胆消化道中脂肪酶活力显著升高(P0.05),淀粉酶活力显著下降(P0.05),胃蛋白酶活力有下降趋势(P0.05);饲料脂肪水平显著影响热胁迫后海胆体腔液中抗氧化酶活力,其中热胁迫2 h后,12%脂肪组超氧化物歧化酶(SOD)活力最高,显著高于15%脂肪组(P0.05);热胁迫6 h后,海胆体腔液过氧化氢酶(CAT)活力最高值出现在6%脂肪组,且高于12%和15%脂肪组。研究表明,6%饲料脂肪水平时中间球海胆幼胆的生长速率最快,6%~12%饲料脂肪水平能够显著提高热胁迫后海胆的抗氧化能力。     

模拟海底水流和光照条件下光棘球海胆行为特征及其聚礁效果的初步研究

为观察光棘球海胆Strongylocentrotus nudus在饱食、饥饿和饥饿再投喂状态下的行为特征,及其对水泥、PVC两种材质模型礁的聚集特性,在实验室中模拟光棘球海胆栖息海域底层的昼夜水流速度和光照强度进行试验。结果表明:当光照强度达到560 lx、水流速度达到20 cm/s(9:00)时,均匀分布的光棘球海胆有90%向模型礁附近区域移动;当光照强度和水流速度下降时,光棘球海胆向模型礁附近区域外移动;运动趋势明显的光棘球海胆在饱食、饥饿和饥饿再投喂3种状态下的平均移动速度分别为0.039、0.041、0.052 cm/s,3种状态下光棘球海胆顺、逆水流运动次数的比值依次为饥饿状态(1.63)饱食状态(1.18)饥饿再投喂状态(0.73),饥饿再投喂状态下光棘球海胆的活跃程度高于饱食和饥饿状态;鱼礁材质也影响光棘球海胆的聚集行为,光棘球海胆在饱食、饥饿和饥饿再投喂状态下对水泥模型礁的平均聚集率分别为25%、17%、24%,对PVC模型礁的平均聚集率分别为16%、7%、12%,光棘球海胆对两种模型礁的聚集效果均为饱食状态饥饿再投喂状态饥饿状态。研究表明,光棘球海胆在饱食和饥饿再投喂状态下对两种模型礁的聚集效果较好,而水泥材质的模型礁比PVC材质的模型礁聚集效果更好。     

海胆微量元素的光谱测定

[目的]了解紫海胆的营养价值。[方法]采用火焰原子吸收光谱法对海胆中Ca、Cu、Mn、Zn、Fe、Na和Mg7种微量元素含量进行测定分析。[结果]结果表明,采用HNO3＋H2SO4（5：1）混酸作消化液处理样品,各元素在试验范围内,加标回收率和精密度较好,加标回收率为93．8％～106．3％．相对标准偏差（RSD）小于5％。海胆中人体所需的微量元素含量丰富,海胆中微量元素含量表现为Ca〉Na〉Fe〉Zn〉Cu〉Mn〉Mg。[结论]该研究为海胆的合理利用提供有利依据。     

不同贮藏条件对鲜黄海胆鲜度的影响

以鲜活黄海胆Glyptocidaris crenulari为原料,采用工厂化加工工艺流程生产鲜黄海胆,研究其在4℃（普通冷藏）、4℃（冰水）和-1℃（超冷）贮藏条件下的细菌总数（TVC）、挥发性盐基氮（TVB-N）、过氧化值（TBARS）和pH值的变化。结果表明：海胆在-1℃条件下可贮藏24 d,细菌总数、挥发性盐基氮、过氧化值和pH值分别为4.6 lg（cfu/g）、285 mg/kg、12.3 mg/kg和6.58;在4℃（冰水）条件下可贮藏16 d,细菌总数、挥发性盐基氮、过氧化值和pH值分别为4.7 lg（cfu/g）、280 mg/kg、17.1 mg/kg和6.82;在4℃条件下可贮藏6 d,细菌总数、挥发性盐基氮、过氧化值和pH值分别为4.7 lg（cfu/g）、275 mg/kg、17.4 mg/kg和6.74。可见,-1℃下贮藏可以明显延长鲜黄海胆的保质期,同时有效抑制不饱和脂肪酸氧化。过氧化值和挥发性盐基氮也可以作为鲜黄海胆鲜度质量的重要指标。     

患病与健康虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)体腔液菌群的PCR-DGGE分析比较

分析比较患病与健康虾夷马粪海胆体腔液菌群的PCR-DGGE指纹图谱.并通过切胶、克隆测序等步骤分析患病虾夷马粪海胆体腔液中的特异菌群.结果显示,健康海胆体腔液中菌群的PCR-DGGE指纹图谱具7个条带,其中有5个与患病海胆相同,2个为不同条带,表明健康海胆体腔液中至少含7种细菌,其中2种以上细菌随机体环境变化而消亡;患...     

用改良的TRIZOL法快速提取仿刺参和中间球海胆的总RNA

用改良的TRIZOL法和普通TRIZOL法分别提取仿刺参Apostichopus japonica体壁、肠、体腔液和中间球海胆Strongylocentrotus intermedius的管足、性腺、齿间肌的总RNA。结果表明:用普通TRIZOL法提取时间长,电泳条带不很清晰,存在降解且各个组织提取的状况不稳定,杂质量多;而用改良TRIZOL法能够快速提取仿刺参、海胆组织的总RNA,电泳后得到的28S rRNA和18S rRNA条带清晰、完整性好、纯度高、得率高,其A/A为2.04~2.14,总RNA浓度为44.96~115.02 ng/μL。     

光棘球海胆性腺氨基酸组成的研究

于2006年5、6、8月测定了光棘球海胆Strongylocentrotus nudus雌、雄个体性腺中氨基酸含量及组成。结果表明：光棘球海胆氨基酸含量为30．75％～48．52％（质量分数,下同）,其中鲜味氨基酸含量为15．33％～21．84％,必需氨基酸含量占氨基酸总量的42．67％-52．50％,鲜味氨基酸含量占总氨基酸含量的43％以上。光棘球海胆中甘氨酸含量最高（3．76％～5．02％）,谷氨酸含量（2．99％～4．79％）次之;雌、雄个体以及排放精、卵时其氨基酸组成变化较大;过熟及迟熟的海胆无论是氨基酸总量,还是必需氨基酸、鲜味氨基酸含量都低于早期成熟海胆;雄性海胆性腺鲜味氨基酸含量高于雌性,因此雄性更美味。研究表明,生产中采集海胆最好在海胆早期成熟阶段,在海胆成熟后期自然排放之前采收完毕。     

虾夷马粪海胆CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析

采用RT-PCR、PCR-SSCP等分子生物学技术和关联分析等方法对虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius CYP51基因的cDNA序列进行了克隆和单核苷酸多态性分析.结果表明:虾夷马粪海胆的CYP51基因包括一个1491 bp的开放阅读框,编码496个氨基酸;其开放阅读框的第161个核苷酸处存在1个单核苷酸多态性,即核苷酸发生了A→G突变.关联分析结果表明,该单核苷酸多态性与虾夷马粪海胆的体质量、性腺质量之间存在显著相关性(P＜0.05).本研究中首次克隆了虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列并进行了SNPs分析,研究结果可为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考.     

中间球海胆性别性状的微卫星分析

针对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius育苗生产中很难进行活体性别鉴定这一特点,采用组织切片法和微卫星标记分析法对海胆进行观察分析。试验用样品由大连太平洋海珍品有限公司提供,共31只。采用组织切片法鉴别雌、雄个体,发现17只个体为雌性,14只个体为雄性。同时,将31只个体分为雌、雄两个群体,提取性腺组织基因组DNA,利用已经筛选好的11对引物对雌、雄两个群体进行微卫星分析。结果表明,两个群体的遗传多样性没有显著差异;发现INST09-A,INST10-A,INST10-B三个等位基因的频率在两个群体间存在极显著差异(P<0.01),位点INST10在雌、雄两个群体中的基因型频率存在极显著差异(P<0.01)。初步说明这些位点及相应等位基因可能与性别决定位点存在一定的连锁关系。     

饥饿和再投喂对中间球海胆性腺发育的影响

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius进行了不同时间的饥饿和再投喂试验。采用各组“饥饿时间 投喂时间”相同的试验设计,在30 d内,试验组(S3、S6、S9、S12组)海胆分别饥饿3、6、9和12d后再连续饱食投喂直至试验结束,同时设对照组S0。结果表明:试验结束时S3组海胆性腺重、性腺指数均接近对照组,其余各组较对照组低;特殊生长率在再投喂的第2 d或第4 d出现最大值。性腺组织学观察的结果表明:对照组海胆性腺为滤泡型,由生殖细胞和营养细胞构成,发育至生长期;随着饥饿时间的延长,雄海胆性腺中成熟精子的数量减少,雌海胆性腺中初级卵母细胞发育迟缓,而雌、雄海胆性腺中营养细胞的数量无明显变化;再投喂后,性腺有不同程度的发育。     

母源因子boule在光棘球海胆性腺中的表达与定位

为鉴定光棘球海胆Mesocentrotus nudus生殖细胞标记基因,通过基因克隆、荧光定量PCR及切片原位杂交等技术分析了光棘球海胆(湿体质量为76.8 g±10.0 g)母源因子(boule)基因的分子特征及动态表达模式。结果表明:光棘球海胆boule cDNA序列全长为1788 bp,其中,3′非编码区为601 bp,5′非编码区为146 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1041 bp,共编码346个氨基酸,包含一个保守的RRM结构域;荧光定量PCR结果显示,boule为母源因子,在整个胚胎发育时期均有表达;boule基因在处于生长期(stageⅡ)光棘球海胆的肠、管足、体腔液和性腺中均有表达,其中,boule基因在精巢表达量最高(P<0.05);在卵巢中表达量随卵母细胞的成熟而逐渐升高,在成熟期(stageⅣ)卵巢中达到最高,精巢中表达量仅在生长期(stageⅡ)及成熟前期(stageⅢ)有较高表达;切片原位杂交显示,boule基因在光棘球海胆精巢的生殖细胞中特异表达,卵巢中未检测到阳性细胞信号。研究表明,光棘球海胆boule基因是雄性生殖细胞标记基因,本研究结果可为海胆雄性生殖细胞发育相关研究提供数据资料。     

虾夷马粪海胆F3代群体数量性状相关性与通径分析

为更全面地分析虾夷马粪海胆F3代的生长与性腺品质,研究测量了虾夷马粪海胆F3代群体12个家系82枚海胆的体尺性状和性腺主要营养成分,其中体尺性状包括壳性状（壳高、壳径、壳湿重、壳干重）,口器性状（口器高、口器宽、口器重）,体重和性腺湿重;营养成分性状包括性腺中的总脂肪含量、总蛋白含量和4种高不饱和脂肪酸含量(C20:4、C20:5、C22:5 、C22:6)。计算了F3代虾夷马粪海胆不同性别体尺性状、营养成分的均值、标准差和变异系数,并对数量性状间的相关关系进行了分析。结果显示：虾夷马粪海胆F3代群体各性状中,雌性群体各性状指标略优于雄性群体,但不同性别间均无显著性差异(P>0.05)。F3代虾夷马粪海胆各体尺性状之间均存在极显著的相关性(P<0.01),其中壳径与体重之间相关性最大(0.878),而口器性状与体重的相关性相对较小。营养成分方面,C20:4(AA)和C20:5(EPA)之间相关性极为显著(P<0.01);C22:5和C22:6(DHA) 之间显著相关(P<0.05),即同碳原子数的不饱和脂肪酸的含量相关显著。营养成分性状与壳高、壳径和体重的相关性均不显著(P>0.05),且多为负相关,在选择育种时应分别考虑。研究结果为虾夷马粪海胆选育潜力评估和下一步选种提供依据,为富含高不饱和脂肪酸虾夷马粪海胆培育奠定理论基础。     

雌二醇对中间球海胆生长、性腺发育及胆固醇代谢的影响

为探讨雌二醇(estradiol)对体质量为(13.58±0.79)g的中间球海胆Strongylocentrotus intermedius性腺发育的调控机制,在室内水槽(200 L)中进行为期60 d的注射试验。试验分对照组、雌二醇(5μg/m L)注射组和他莫昔芬(tamoxifen)(25μg/m L)注射组,每3 d注射1次,并于第30天和第60天时两次取样测定海胆增重率(WGR)、性腺指数(GSI)、性类固醇激素含量和胆固醇合成相关基因的表达量。结果表明:注射雌二醇或他莫昔芬并未显著影响海胆的生长速率,却显著影响试验末期海胆的性腺指数,雌二醇组海胆性腺指数显著高于对照组和他莫昔芬组(P0.05);试验结束时,雌二醇组和他莫昔芬组海胆体腔液中雌二醇含量和性腺中胆固醇含量均显著高于对照组(P0.05),雌二醇组海胆性腺中雌二醇含量最高,显著高于对照组和他莫昔芬组(P0.05);雌二醇组海胆性腺和消化道中主要卵黄蛋白(MYP)基因均高于对照组,但均未有显著性差异(P0.05);雌二醇组和他莫昔芬组海胆性腺和消化道中性类固醇激素合成关键基因CYP17和胆固醇合成关键基因CYP51表达量均显著高于对照组(P0.05);他莫昔芬组海胆性腺中CYP17和CYP51基因表达量均低于雌二醇组(P0.05)。研究表明,注射雌二醇显著提高了中间球海胆性腺指数、体内雌二醇含量和雌二醇合成相关基因的表达量,这可能是雌二醇促进海胆性腺发育的调控机制。     

Unusual pattern of accumulation of mRNA encoding EGF-related protein in sea urchin embryos

A sea urchin (Strongylocentrotus purpuratus) messenger RNA encoding a protein (SpEGF2) related to epidermal growth factor (EGF) was identified. The full-length complementary DNA sequence predicts a protein with an unusually simple structure, including four tandem EGF-like repeats and a hydrophobic leader, but lacking a potential transmembrane domain. Sequence similarities suggest that the peptides are homologous to two peptides from a different sea urchin species, which cause a classic developmental defect, exogastrulation, when added to the seawater outside of embryos. The SpEGF2 messenger RNA begins to accumulate at blastula stage, and in pluteus larvae it is distributed in discrete regions of ectoderm that are not congruent with known histological borders. One region corresponds to that expressing the homeodomain-containing protein, SpHbox1. The structure of the SpEGF2 protein and the pattern of accumulation of its messenger RNA suggest that it may have important functions as a secreted factor during development of sea urchin embryos.     

虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增（ RACE）技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus in-termedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1（GenBank： HQ259110）,并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明： SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠; SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725-750位有跨膜区,发现1个信号肽（1-32aa）、1个亮氨酸重复富集区（LRR）; SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌（ P〈0.05）;经V. fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h 时略有升高。研究表明, TLR 基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。     

海洋酸化和升温对中间球海胆幼虫发育和生长的影响

为了研究海洋酸化和气候变暖对海洋生物的联合作用,按照文献[4]和[7]中对海洋环境变化的预测趋势,设置了3组海水,即对照组(pH为7.93～7.99,水温T为18℃)、试验组E3(在对照组基础上pH减小0.3,T升高3℃)、试验组E6(在对照组基础上pH减小0.6,T升高6℃),在此条件下对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius幼虫的发育及生长情况进行了研究。结果表明:酸化及升温海水对海胆孵化率没有显著影响;E3组海胆与对照组发育进程一致,而E6组则较慢;E3和E6组海胆分别存活了18 d和12 d,分别发育至八腕幼虫和四腕幼虫阶段,可见试验海水环境严重影响海胆幼虫的存活;E3组海胆幼虫的生长在受精后的前10 d与对照组差异不显著(P>0.05),之后显著低于对照组(P<0.05),而E6组海胆幼虫的生长在整个试验阶段均显著低于对照组(P<0.05);将骨针长度分解为口后腕骨针长度和躯干部骨针长度,各组海胆的生长差异主要表现在口后腕骨针长度上;试验组长腕幼虫畸形均不同程度地表现为腕短小、萎缩、腕骨针折断、骨针弯曲变形等。研究表明,中间球海胆对海洋酸化和气候变暖的海洋环境非常敏感,如果按照预测趋势,海洋环境变化将会对该海胆产生严重的负面影响。     

High macromolecular synthesis with low metabolic cost in Antarctic sea urchin embryos

Assessing the energy costs of development in extreme environments is important for understanding how organisms can exist at the margins of the biosphere. Macromolecular turnover rates of RNA and protein were measured at -1.5 degrees C during early development of an Antarctic sea urchin. Contrary to expectations of low synthesis with low metabolism at low temperatures, protein and RNA synthesis rates exhibited temperature compensation and were equivalent to rates in temperate sea urchin embryos. High protein metabolism with a low metabolic rate is energetically possible in this Antarctic sea urchin because the energy cost of protein turnover, 0.45 joules per milligram of protein, is 1/25th the values reported for other animals.     

马粪海胆壳棘多糖的分离、纯化和抗肿瘤活性的研究

马粪海胆Hemicentrotus pulcherrimus壳棘经脱脂、热水煮沸、浓缩、去蛋白、去核酸、脱色和分级等一系列步骤,得到硫酸多糖XB-1;利用高效液相色谱仪等检测该多糖的相对分子质量为190万,并证明其组分具有均一性;XB-1经水解、衍生化和气相色谱分析,确定其单糖组分为岩藻糖和硫酸基;采用正交试验确定了XB-1的最佳提取条件;体外抗肿瘤试验结果显示,XB-1对肺腺癌细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞均有不同程度的抑制作用。     

北方海区经济海胆性腺脂肪酸组成与β-胡萝卜素含量的比较研究

海胆性腺中脂肪酸含量丰富,β-胡萝卜素含量高,是一种营养价值较高的食物来源,不同种、不同群体间、不同性别海胆性腺中二者的组成与含量存在差异。对我国北方海区4种经济海胆(虾夷马粪海胆、光棘球海胆、马粪海胆和海刺猬)以及大连黑石礁、旅顺、獐子岛3个群体的光棘球海胆性腺中的脂肪酸组成及β-胡萝卜素含量进行了测量和分析。结果显示:不同种海胆、同种海胆的不同群体及不同性别海胆性腺中脂肪酸、β-胡萝卜组成与含量均存在差异。不同种海胆间,光棘球海胆性腺中脂肪酸种类最多为31种,虾夷马粪海胆性腺中种类最少为24种;不同群体的光棘球海胆间,黑石礁群体性腺中脂肪酸种类最多为29种,旅顺群体最少为26种。雄性、雌性马粪海胆性腺中β-胡萝卜素含量均显著高于其他3种雌性海胆(P<0.01)。3个群体的光棘球海胆性腺中,黑石礁群体雄性性腺β-胡萝卜素含量显著低于其他2个群体(P<0.05);獐子岛群体雌性性腺中β-胡萝卜素高于其他2个群体,差异极显著(P<0.01)。上述结果为进一步开展海胆杂交及海胆优良品种的选育奠定了基础。