KSOM无血清培养液在绵羊胚胎体外培养应用的研究

本文利用KSOM、TCM-199+20％人血清和KSOM+20％人血清培养绵羊体外受精胚胎,以研究KSOM作为绵羊胚胎体外培养无血清培养液的可能性。实验结果说明,KSOM支持绵羊胚胎早期发育至囊胚期,而在KSOM中添加血清后,胚胎可发育至孵化囊胚,而且孵化囊胚率高于常用的TCM-199+血清(24％vs 7％)(p<0.05)。说明KSOM可以用于绵羊胚胎早期发育的无血清培养液。     

透明质酸对绵羊卵母细胞体外成熟与早期胚胎发育的影响

[目的]探讨不同浓度透明质酸对绵羊卵母细胞的体外成熟和早期胚胎发育效果的影响。[方法]以绵羊卵母细胞为试验材料,分别在绵羊卵母细胞体外成熟和体外胚胎培养液中添加0、1.5、3.0、4.5 mg/ml的透明质酸（HA）,研究其对绵羊卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。[结果]当HA浓度为1.5和3.0 mg/ml时,绵羊卵母细胞的成熟率分别为72.54%和62.17%,显著高于对照（P〈0.05）。当HA浓度介于1.5～3.0 mg/ml时,HA对绵羊卵母细胞体外成熟有促进作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,绵羊卵母细胞的卵裂率和囊胚率均显著高于对照组与其他组（P〈0.05）,囊胚细胞总数显著高于其他各组（P〈0.05）。这说明HA可以促进绵羊卵母细胞的早期胚胎发育。[结论]HA不仅可以促进绵羊卵母细胞成熟,而且在细胞分化中也会起作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,最有利于绵羊的早期胚胎发育。     

牛胚胎分割及半胚移植研究

对来自黑白花及西门塔尔超排母牛的７～８日龄胚胎，采用手持微玻璃针，在普通解剖镜下进行分割。通过非手术法将裸半胚移入发情后７天的受体牛黄体侧子宫角。在太原市郊奶牛场及太行山区农民户养牛中，共移植受体牛４５头，结果妊娠产犊２５头，移植成功率为５５．６％。     

不同试验条件对绵羊冲胚效果的影响

湖羊是江浙地区常见的绵羊品种之一,繁殖性能优越,肉质鲜嫩,营养丰富,为了进一步探索湖羊的繁殖潜力,采用CIDR+PMSG+PG+FSH法对湖羊进行同期发情和超数排卵,并在此基础上对发情母羊进行腹腔镜子宫角输精;采用相同输精密度、不同输精时间(撤栓后48、54、60 h)分别对发情母羊进行腹腔镜子宫角授精,通过冲胚进行卵子受精率和可用胚胎率检查,探究对湖羊进行腹腔镜子宫角输精时的最适输精密度与最适输精时间。结果表明,输精密度为2×10⁸个/mL组的卵子受精率和可用胚胎率显著低于其余4组(P<0.05),其余4组差异不显著(P>0.05);撤栓后48 h输精组与撤栓后54 h输精组可用胚胎率差异不显著(P>0.05),但均高于撤栓后60 h,且差异显著(P<0.05);不同输精密度的鲜精以及不同输精时间均会对湖羊卵子受精率和可用胚胎率产生一定的影响,输精密度为3×10⁸个/mL可以作为湖羊鲜精输精的最低有效密度,撤栓后48～54 h输精可以作为湖羊腹腔镜子宫角输精的最佳时间。     

绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚的构建及体外发育研究

【目的】以绵羊卵母细胞为受体,构建绵羊-绵羊和山羊-绵羊体细胞克隆胚,比较其体外发育能力,探讨绵羊卵母细胞对异种体细胞核的再程序化能力。【方法】以体外成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊及山羊胎儿成纤维细胞为核供体,经卵母细胞去核、注核、重构胚电融合、激活等一系列操作,构建同种绵羊-绵羊及异种山羊-绵羊体细胞的克隆胚,比较其体外发育能力。【结果】同种间克隆胚的囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚(7.4%)。异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显著低于同种间克隆胚。2种克隆胚在2-细胞到8-细胞期间的发育速度基本相同,但异种间克隆胚在8-细胞到囊胚期间的发育速度明显低于同种间克隆胚,两者相差12~24 h。【结论】绵羊卵母细胞对异种体细胞核具有再程序化能力,但这种再程序化能力明显低于其对同种体细胞核的再程序化能力。     

Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

该研究旨在探讨外源Ghrelin对绵羊卵母细胞体外成熟的调控作用。在成熟培养液中分别添加浓度为0、100、200和300ng/m L的Ghrelin,进行绵羊卵母细胞体外培养,成熟培养24h,观察统计处于MII期的细胞数目。选择最佳添加浓度,在体外成熟培养0、6、8、14、16、24h,通过Hoechst33342染色持续检测卵细胞中细胞核成熟随时间变化,并对不同培养时期细胞进行实时荧光定量PCR检测,以证明细胞质量相关基因的相对表达量。成熟培养24h时,添加0、100、200、300 ng/m LGhrelin组卵母细胞成熟率分别为:63.7%(220/345)、69.4%(230/332)、85.6%(270/316)、75.9%(231/305)。200ng/m L Ghrelin组显著高于对照组(P0.01),其余组并未显著高于对照组(P0.05);染色证明:200ng/m L Ghrelin组于成熟培养0h、6h、14h、16h到达GV、GVBD、MI、MII期(P0.05);实时荧光定量PCR证明:对卵母细胞成熟GV、GVBD、MI、MII期,Ghrelin受体基因GH-SR-1a和卵母细胞质量相关基因OCT-4、GLUT1和IFNT的相对表达时间提前,但并不显著影响这些基因的表达水平。外源Ghrelin参与了绵羊卵母细胞的体外成熟调控,可在没有改变其成熟过程的前提下加速卵母细胞的体外成熟过程,但对绵羊卵母细胞的质量和进一步发育相关的基因的表达没有明显影响。     

绵羊胚胎细胞核移植的研究

采用国产药品和试剂对绵羊进行超数排卵和胚胎细胞核移植。以 McGrath Solter 和Willadsen 两种去(注)核方法,将8-细胞胚胎细胞核经电融合植入去核成熟卵母细胞内,并经琼脂包埋和中间受体培养,使移核胚胎发育。实验结果表明:(1)用国产激素和化学药品进行绵羊胚胎细胞核移植可使移核胚胎在中间受体内发育为囊胚或桑椹胚;(2)去核时卵母细胞质剩得过少可导致移核胚过早(6-细胞期)发生致密化或形成内细胞团细胞数目较少的小囊胚;(3)Willadsen 去(注)核方法的去核和注核操作成功率明显优于 McGrath-Solter 方法;应用McGrath Solter 法的去核率仅为60%;(4)强度为0.63KV/cm,持续160微秒(μs)的一次电脉冲获得的胚胎融合率最高,达71.2%;以同样电场条件刺激未去核卵母细胞的孤雌活化率在71.4%。     

绵羊胚胎冷冻保存及移植的研究

本研究的目的在于建立绵羊胚胎的慢速冷冻和玻璃化快速冷冻保存方法,为绵羊胚胎移植技术应用于生产提供保证。结果:慢速冷冻保存,解冻后正常胚胎占72％,移植受体的受胚率33％、产羔率66％。玻璃化快速冷冻保存,解冻后正常胚胎率亦达72％,移植受体3只,产羔4只。     

不同培养体系对绵羊体外受精胚胎发育及细胞凋亡的影响

[目的]通过SOFaaBSA和CR1 aaBSA - FBS两种培养液对体外胚胎发育率及胚胎凋亡发生的影响,筛选适合绵羊体外受精胚胎发育的培养体系,为相关研究提供一定的理论依据和研究基础.[方法]采用激光共聚焦显微镜和细胞原位凋亡检测技术(TUNEL),分析这两种胚胎体外培养系统的绵羊体外受精胚胎发育的影响及各发育阶段的细胞凋亡状况及对胚胎发育的影响.[结果]SOFaaBSA和CR1aaBSA- FBS组的卵裂率、囊胚率和囊胚孵化率均高与其它实验组,但这两组之间差异不显著(P＞0.05).同时,在两种培养液培养的2细胞、3-8细胞期的绵羊体外受精正常形态的胚胎中均未发现凋亡信号,凋亡信号在两种培养液中都是首次出现在9- 16细胞胚胎细胞中,并且随着胚胎发育至囊胚期,凋亡细胞效随着胚龄增长越来越多.在SOFaaBSA培养液培养的桑椹胚和囊胚细胞胚胎凋亡率显著低于CR1aaBSA - FBS培养液培养的桑椹胚和囊胚(P＜0.05),同时,在CR1aaBSA- FBS培养液中桑椹胚和囊胚细胞平均具有凋亡细胞的数量显著高于SOFaaBSA培养液(P＜0.05).[结论]CR1aaBSA- FBS培养系统显著的增加了绵羊晚期体外胚胎的凋亡.CR1 aaBSA - FBS能够支持绵羊体外受精胚胎的发育,但SOFaaBSA培养液更适合绵羊体外胚胎的发育.     

奶牛胚胎分割移植试验研究

用简单方法直接分割7～8日龄新鲜胚胎(一分为二),裸半胚成对移植给66头受体,90d 妊检,移植妊娠率为56.1%(37/66)。除6头流产和尚有5头待产外,已有26头受体产犊35头,其中有9对同卵双胎,双胎率为34.6%(9/26),半胚产犊率为29.2%(35/110)。对影响成对半胚移植妊娠率和半胚产犊率的因素如胚胎质量、胚胎在体外停留时间、胚胎发育阶段、黄体状况、受体牛品种等进行了较系统的研究。此外对冷冻胚胎进行了分割试验,移植妊娠率为45.5%(5/11),产3头犊牛。对快速冷冻和常规冷冻胚胎分割后的移植妊娠率进行了比较,分别为25.0%(1/4)和57.4%(4/7)。     

微滴中胚胎数量对猪孤雌胚早期体外发育的影响

[目的]优化猪早期胚胎培养体系,为单精子显微受精及体细胞核移植等研究提供依据。[方法]以猪的早期孤雌胚胎为材料,分别将人工激活后的70、50、30、15和5枚卵母细胞放入100μlNCSU-23培养液的微滴中进行培养,探讨了胚胎培养数量对猪早期孤雌胚发育的影响。[结果]100μl的培养微滴中培养30、50和70胚胎组,其分裂率分别为64.0%、65.2%和67.1%,显著高于5胚胎组,而与15胚胎组的差异不显著 在囊胚率方面,70胚胎组的最高,为3.0%,与50胚胎组的（1.7%）无显著差异,与5、15和30胚胎组的差异显著 各组的囊胚细胞数之间没有显著差异。[结论]在该研究条件下,当微滴体积为100μl时,培养50~70枚猪孤雌胚胎的效果最好,即,胚胎数∶培养滴体积=（1∶1.43~2.00）。     

不同培养方式对大花蕙兰试管苗生长的影响

以大花蕙兰(Cym bidium)试管苗为试验植物材料,以树脂膜容器(CP)和玻璃培养瓶作为培养容器,比较不同培养方式对大花蕙兰试管苗生长的影响.结果表明,与常规玻璃培养容器相比,以岩棉块作为培养基支持体,并配合CP使用的培养方式(CP.RW)对促进大花蕙兰试管苗生长效果显著.     

不同取胚时期对葡萄杂交胚培养的影响

对无核白等4个葡萄品种的杂交胚在不同时期取胚培养,对胚发育和萌发结果进行曲线回归,通过回归方程和拟合曲线找出不同杂交胚生长发育的特点和规律.结果表明,不同杂交胚适宜的取胚时期各不相同.回归方程中常数越大,其对应的杂交胚越容易培养,其发育率和萌发率较高.取胚时期内,多数杂交胚发育和萌发的变化趋势表现为峰形曲线.     

不同冻存保护剂对绵羊前体脂肪细胞冻存效果的影响

【目的】探讨绵羊前体脂肪细胞冷冻保存的最佳冻存保护剂种类和浓度。【方法】在含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中分别添加不同浓度的DMSO、EG、PG、G和PVP作为冻存液,对原代培养的绵羊前体脂肪细胞进行冷冻保存后,检测复苏细胞存活率、细胞增殖能力、细胞中脂肪沉积量,测量GPDH活性,并用实时荧光定量PCR检测PPARγ和LPL mRNA的表达水平,最后对复苏细胞进行染色体核型分析。【结果】各种冻存保护液中,10% DMSO和5% DMSO+5% PVP组细胞存活率最高,与对照组相比差异不显著（P＞0.05）,其它各试验组复苏细胞存活率均显著低于对照组（P＜0.05）;各试验组中10% DMSO组细胞增殖能力最强,且与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;细胞复苏后培养6 d,各试验组脂肪沉积量与对照组之间没有显著差异（P＞0.05）,而第11天时,10 % DMSO组脂肪沉积量显著高于其它试验组（P＜0.05）,且与对照组相比差异不显著（P＞0.05）;各试验组GPDH活性和LPL、PPARγ mRNA 的表达量与对照组之间没有显著差异（P＞0.05）;染色体核型分析发现,复苏细胞二倍体细胞占主体,与原代细胞没有显著差异（P＞0.05）。【结论】含20% FBS的DMEM/F12培养液中添加10% DMSO或10%PVP、5% DMSO+5% PVP均能有效保存绵羊前体脂肪细胞,但以10% DMSO最佳。     

用组培技术早期挽救马铃薯杂种幼胚的研究

马铃薯不同种、品种及倍性间杂种浆果早期脱落,使杂交籽粒无法成活。将这些授粉后不久脱落的子房采集下来进行离体培养,或将胚取下直接培养。基本培养基为MS,制成液体和固体两种培养基,不加或附加不同种类及水平的激素。胚直接培养是一较好方法,幼胚与子房一同接种只有子房膨大,而幼胚却不再发育。固体培养基效果优于液体培养基。对胚在人工培养前的发育时期进行了解剖研究,证明心形胚是形成完整植株的最早时期。     

中国荷斯坦牛冷冻胚胎分割移植试验研究

牛胚胎冷冻的成功，使胚胎移植技术不受时间、地域的限制，并且可以做到对受体进行选择，从而可提高移植妊娠率；牛胚胎分割的成功，是增加胚胎数目和生产同卵双犊或多犊、获得更多牛犊的一个有效方法。如果将胚胎冷冻和胚胎分割技术结合起来，那未就可以达到既增加胚胎数目，降低胚胎移植成本，又利于胚胎移植技术在生产中推广应用的双重目的，为此开展此项研究。将用１０％甘油为冷冻剂，８枚７日龄中国荷斯坦奶牛的冷冻胚胎，在３５℃水浴解冻，用１．０ｍｏｌ／Ｌ蔗糖液脱除抗冻剂，７枚可用胚胎用简单方法分割成１４枚半胚，将裸半胚成对移植于与胚胎日龄同步的７头受体牛。结果３头妊娠，移植妊娠率为４２．９％（３／７），共产５头牛犊，其中２头产同卵双犊，半胚产犊率为３５．７％（５／１４），按整胚计算产犊率为７１．４％（５／７），较同期未分割的冷冻胚胎的产犊率３７．８％（１７／４５）提高３３．６个百分点。     

胚胎分割技术在牛育种中的研究进展

胚胎分割技术是动物克隆技术之一,是胚胎生物工程技术的重要组成部分。牛胚胎分割技术是在牛胚胎移植技术的基础上发展起来的,其研究已经较为完善。牛胚胎分割的成功,是增加胚胎数目和生产同卵双胎或多胎、获得更多牛犊、扩大优良畜种繁殖后代的有效方法。笔者对胚胎分割技术在牛育种方面的应用进行了介绍。