猪白细胞介素2／6嵌合基因的融合表达及活性

采用重叠延伸PCR（SOE—PcR）方法通过一基因柔性接头（linker）将猪白介素2（PoIL-2）、6（PoIL-6）基因构建成PoIL-2linker-PoIL-6嵌合基因并克隆入pQE-30原核表达载体中进行融合表达;对表达的重组融合蛋白（rPoIL-2qinker-PoIL-6）进行纯化。分别检测rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应及促猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖活性。结果显示：成功构建了PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重组原核表达质粒（rpQE-30／PoIL-2-linker-PoIL-6）。表达的rPoIL-2linker-PoIL-6蛋白相对分子质量约28000,蛋白经纯化后纯度在96％以上。rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白分别具有与单一重组PoIb2、PoIL-6蛋白（rPoIL-2、rPoIL-6）对照相近的生物学活性,可与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并可显著促进猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖。结果表明,rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白在体外具有单一rPoIL-2和rPoIL-6蛋白的双重生物学活性,这为下一步进行rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在动物体内活性研究奠定了基础。     

荣昌猪白细胞介素-2基因的原核表达

应用DNA重组技术,将克隆的荣昌猪白细胞介素-2基因亚克隆到PET-32a( )表达载体上,构建重组表达载体。酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用1 mM的HPTG诱导表达重组蛋白。RT-PCR方法检测表明白细胞介素-2基因得到了转录;对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量约37 Ku处有明显的蛋白质条带,而对照组无相应条带产生。最后用MTT法检测表达蛋白的生物学活性,表明所获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,这为利用该蛋白及其基因研制高效抗病免疫制剂和基因工程疫苗奠定了良好的基础。     

猪白细胞介素-2的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自刀豆素（Con A）刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪白细胞介素-2（porcine interleutin-2,PoIL-2）成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪白细胞介素-2（rPoIL-2）蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用MTT法测定rPoIL-2蛋白促小鼠细胞毒性淋巴样系CTLL-2株细胞增殖活性以评价rPoIL-2的活性。结果表明,成功克隆了rPoIL-2的成熟肽基因,基因全长405 bp,编码134个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子质量大小约为16.5 ku,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白质纯度在96%以上;纯化的rPoIL-2蛋白促小鼠CTLL-2株细胞增殖活性最高值是对照细胞的3倍。本研究成功表达了具有生物学活性的PoIL-2蛋白,为新型基因工程抗病毒制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。     

猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。     

鸡白细胞介素-6原核表达及双抗夹心ELISA方法的建立

应用分子生物学技术原核表达ChIL-6,以ChIL-6重组蛋白为免疫原,按免疫程序分别制备兔抗和鼠抗IL-6重组蛋白的多克隆抗体。应用此抗体建立双抗夹心EL-ISA方法后,为了优化此方法本试验对该方法的最佳试验条件、标准曲线、重复性和初步应用进行确定。结果显示,经SDS-PAGE和Western-blot分析,表明ChIL-6在大肠杆菌中正确表达,为了建立检测ChIL6的双抗夹心ELISA方法,本试验应用表达的重组蛋白制备兔抗和鼠抗多克隆抗体。建立的双抗夹心ELISA方法最佳反应条件为包被抗体的质量浓度为50mg／L,4℃过夜;酶标二抗稀释度为1：400,37。C1h;应用该方法检测感染金黄色葡萄球菌后的ChIL-6,其结果与本实验室之前应用人的ELISA试剂盒检测的结果相似。结果表明,本试验建立的检测ChlL-6的双抗夹心ELISA方法可用于临床。     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3．1-pIL-18为模板，采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18（IL-18）的成熟蛋白基因，通过KpnⅠ＋SacⅠ双酶切及连接反应，构建了pET32c—pIL—18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实，重组质粒中的基因片段连接正确。之后，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃、1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子质量约为33ku处出现了预期的目的蛋白。用8mol／L脲对表达产物变性，经Ni^2＋NTA柱纯化，透析复性，得到了纯化的IL-18蛋白。Western—blot分析证实，纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

猪白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

本研究通过RT-PCR方法从用ConA刺激的猪外周血淋巴细胞中扩增出猪IL-15(pIL-15)编码序列的cD-NA,将其克隆至T载体pMD18-T后,序列测定表明pIL-15基因长度为489 bp,编码162个氨基酸。进一步通过PCR方法获得缺失其N端48 aa的信号肽序列的成熟pIL-15蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-28a的6×His下游,构建重组表达质粒pET-pIL15,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,重组菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到分子量约为15 ku的重组蛋白,其表达量占总菌体蛋白量的17.5%。Western blot试验也证实表达的重组融合蛋白6×His-pIL15能够很好地与抗6×His单抗发生反应。猪IL-15基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

猪白细胞介素-2重组蛋白的原核表达及其生物学活性分析

用已构建好的重组表达载体pET30-IL2转化BL-21E.coli,挑取单克隆,利用诱导剂IPTG诱导表达;通过改变诱导剂的浓度、诱导的时间来摸索最佳诱导条件,在最佳诱导条件下大量表达,并利用镍层析柱纯化重组蛋白,用MTS法测定其生物学活性。结果表明,表达产物经SDS-PAGE分析,表达出25ku的融合蛋白,表达产物主要以包涵体的形式存在,最佳的诱导剂浓度为0.1mM,最佳的诱导时间为4h;对表达产物的包涵体处理后,用镍琼脂糖凝胶FF纯化,所得蛋白的纯度约在90%以上。通过透析除去部分尿素,复性后在体外利用MTS法检测其生物学特性,结果表明其仍具有较好的生物学活性,这为进一步大量制备和研究猪IL-2重组蛋白奠定了基础。     

鸡白细胞介素-2原核表达与生物学活性初探

根据pGEX-6p-1表达载体多克隆位点,设计带有限制性内切酶酶切位点的IL-2引物,RT-PCR克隆获得目的基因,连接pGEM-T载体,转化JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选、测序和双酶切鉴定,与pGEX-6p-1表达载体连接,转化BL21感受态细胞,经双酶切和PCR鉴定,用IPTG诱导表达,通过菌体裂解、包涵体洗涤、溶解、复性、Sepharose 4B柱层析,SDS-PAGE和Western blot检测,证明表达并纯化了IL-2融合蛋白,而且纯化的IL-2融合蛋白具有促进淋巴细胞增殖的特性.     

荣昌猪白细胞介素-2受体γ链基因克隆、表达与鉴定

运用RT-PCR技术从由刀豆蛋白(ConA)诱导培养的荣昌猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)扩增出猪白细胞介素-2受体γ链基因的完整开放阅读框(ORF),长约1 107 bp,编码由368个氨基酸残基组成的相对分子质量为41 780的蛋白多肽.荣昌猪IL-2Rγ与人、猕猴、牛、犬、鼠在氨基酸水平上的同源性分别为81.6%,80.8%,85.1%,83.2%和68.8%.运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rγ,开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因,共1 020 bp.将其定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)后在E.coli BL21中诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为52 000,重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占茵体总蛋白的37.6%;Western-blotting分析表明,在相对分子质量52 000处有一奈特异性的带;对γ诱导重组茵进行转录检测得到约1 020 bp的特异性片段.     

Establishment of swine interleukin-6 sandwich ELISA

We established a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for swine interleukin-6 (SwIL-6), which was applied for detection of SwIL-6 in vitro and in vivo. Anti-SwIL-6 rabbit- and goat-polyclonal antibodies, and monoclonal antibody (mAb) were prepared, conforming that all of the antibodies were reactive with recombinant SwIL-6 by Western blotting and indirect ELISA. A sandwich ELISA was developed using the mAb as a capture antibody and biotinylated goat-polyclonal antibody as a detection antibody. The detection limit of the sandwich ELISA for rSwIL-6 was 49pg/ml and did not show cross-reactivity with swine IL-1b, IL-4, IL-8, IL-18, IL-12, and IFN-g. Using the ELISA, SwIL-6 was detected in culture medium of the monocytes stimulated with PHA-P and PMA, and the plasma or the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of pigs experimentally infected with Actinobacillus pleuropneumoniae or Mycoplasma hyopneumoniae. This ELISA for SwIL-6 may be useful for understanding the role of this cytokine in various swine diseases.     

Expression and characterization of the recombinant swine interleukin-6

The swine interleukin-6 (SwIL-6) cDNA was cloned by RT-PCR and each expression system of recombinant SwIL-6 in Escherichia coli, insect cells, and mammalian cells was developed. Recombinant SwIL-6 produced in bacteria was applied for generation of the polyclonal antibodies. The rSwIL-6 was purified from supernatant of insect cells with a Q-sepharose or anti-SwIL-6 monoclonal antibody based immunoaffinity column. The antibodies showed that the molecular weight of rSwIL-6 was approximately 26kDa in E. coli, 25, 26, 30kDa in insect cells, and 26 and 30kDa in mammalian cells. These variations of molecular weight were probably due to the different modifications of glycosylation. All these recombinant proteins retained the antigenicity and biological activity on 7TD1 mouse cells.     

鸡IL-18成熟蛋白基因变构体毕赤酵母表达载体的构建及表达

为使鸡IL-18成熟蛋白基因在真核系统中高效表达,对其进行定点突变,将酵母低频密码子突变为偏嗜性密码子,构建了鸡IL-18成熟蛋白变构基因真核重组表达载体pPICZαA-MChIL18*,并将其转化入P.pastoris X-33.重组菌株X-33/pPICZαA-MChIL18*经甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE检测,结果在约23 000处有目的条带,与预期的相对分子质量一致,占总蛋白的45%,对其进行Western-blot检测,结果与兔抗鸡IL-18多克隆抗体发生特异性免疫反应.结果表明,鸡IL-18成熟蛋白变构基因在毕赤酵母中成功的进行了表达.     

人白细胞介素18原核表达载体的构建及其表达

白细胞介素18(IL-18)是一种新发现的具有多种活性的细胞因子,最初被命名为IFN-γ诱导因子(IG IF)[1],1996年,日本研究者U sh io[2]等从正常人肝细胞cDNA文库得到人IG IF基因克隆,将其正式命名为IL-18。hIL-18基因编码193个氨基酸前体蛋白,N端有36个氨基酸前导序列,无N端糖基化位点和亲水信号肽位点。在IL-1β转换酶(ICE)酶切下,成为含157个氨基酸残基的成熟有活性的蛋白,分子量为18kD[2]。IL-18通过与其受体[3](IL-18R)相结合发挥生物学活性,其最具特征的活性是诱导IFN-γ的产生,促进T细胞和NK细胞的增殖,刺激Th1细胞分泌I…     

ELISA在猪伪狂犬病诊断中的应用

近年来 ,猪伪狂犬病不断传播蔓延 ,给世界养猪业带来了巨大危害 ,因此开发特异性强、敏感性高、简便、快速、能区别疫苗毒和野毒、能检出潜伏感染的诊断方法是防制该病的关键之一。EL ISA方法具有特异、敏感、快速、稳定等特点 ,为广大兽医工作者所关注。目前 ,国内外关于 EL ISA在猪伪狂犬病诊断中的应用方面的研究已有不少 ,已有试剂盒出售。笔者综述了应用于猪伪狂犬病诊断的多种 EL ISA方法 ,如直接 EL ISA、间接 EL ISA、竞争 EL ISA、斑点EL ISA、SPA-EL ISA、双抗体夹心 EL ISA、单抗夹心 L AB-EL ISA、血清学鉴别 EL ISA等。这些方法中 ,有测病毒的 ,有测抗体的 ;有单抗介导的 ,有多抗介导的 ;有的还引入了 SPA和 L AB;有的以分子生物学为基础并能够鉴别疫苗毒和野毒。此外 ,还总结了目前所用 EL ISA诊断方法的优点和缺点 ,并预测了其发展前景     

猪传染性胃肠炎病毒YK株N基因的原核表达与N蛋白的生物学活性检测

将猪传染性胃肠炎病毒的N基因克隆到表达载体pET28a后,转化到BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中.通过筛选表达温度和IPTG的浓度,使N基因在原核表达系统中表达并使目的表达产物产量达到最高值.将诱导表达的产物进行SDS-PAGE蛋白电泳和Western检验,证明该表达产物是猪传染性胃肠炎病毒的N蛋白.试验结果说明,猪传染性胃肠炎病毒N基因能够在原核表达系统中大量表达,而且表达的蛋白质具有生物学活性.     

猪肌生成抑制素C末端80氨基酸编码基因的合成及其原核表达

将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1 126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段(F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F6、R3、R2、R1),采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20 bp序列交叉重叠.F1长38 bp,R1长36 bp,其他片段均40bp长,F1和R1片段两端分别加上限制性内切酶Nco I和Xho I的识别位点序列.经PCR扩增出254 bp片段,该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致,表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体.从阳性细菌中提取质粒,经Nc0 I和Xho I酶切,回收254 bp目的片段,定向克隆到pET28a中,转化DH5.受体菌,提取质粒,再转化到BL21(DE3)中,成功筛选出阳性克隆.阳性菌经IPTG诱导,通过SDS PAGE,检测出猪肌生成抑制素的表达.     

猪IL-2与IL-6的融合表达及活性研究

为获得具有猪白细胞介素-2(pIL-2)和猪白细胞介素-6(pIL-6)双重活性的融合蛋白,研究其作为高效免疫佐剂的可行性,本研究利用基因重组技术将克隆到的pIL-2和pIL-6的成熟肽基因利用一段柔性Linker序列串联后插入到原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌,42℃诱导表达得到融合蛋白pIL-6-2,对蛋白进行纯化复性后用MTT法检测其生物学活性。结果显示不同浓度pIL-6-2蛋白对小鼠脾淋巴细胞的增殖活性差异很大,0.1μg/mL浓度的pIL-6-2活性最好。本研究为利用该蛋白作为高效免疫制剂的应用奠定了良好基础。     

马铃薯WRKY6基因的克隆、序列分析与原核表达研究

在高等植物中WRKY转录因子家族成员众多,它广泛参与植物对生物胁迫、非生物胁迫、生长发育和代谢过程的调控。本研究采用同源序列克隆的方法获得马铃薯WRKY6基因,序列分析表明该蛋白属于WRKY家族第3组成员,锌指结构为C-X7-C-X23-H-X-C。构建系统发育树结果表明它与拟南芥WRKY70亲缘关系较近,相似性达58%。然后将其完整编码区构建到大肠杆菌表达载体。在培养温度18℃条件下添加0.2 mmol/L IPTG(异丙基硫代半乳糖苷),诱导培养8 h可获得高表达融合蛋白。进一步实验获得特异性和纯度非常高的纯化蛋白。本研究为进一步确定该蛋白的体外活性及生物学功能奠定了坚实基础。