桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆桃（Prunus persica）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1 kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为Pppgip。PpPGIP分子量为36.4 kD,等电点为7.42,信号肽为N端24个氨基酸残基,具有7个潜在的N-糖基化位点。Pppgip与李属其它pgip核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.2%～94.6%和89.7%～92.7%。同源树分析表明,该基因明显区别于其它pgip,与马哈利樱桃pgip的关系较近,与寿星桃、桃栽培品种‘久保’等pgip的关系都较远。该基因所编码的蛋白质的三维结构含11个α-螺旋和21个β-折叠,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,重组蛋白主要以包涵体形式出现。【结论】克隆了桃PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

毛果杨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP的生物信息学分析

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）可特异性识别病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶,从而抑制病原菌对植物细胞壁重要成分——果胶的降解,以增强植物病原菌抗性。为探明模式树种杨树PGIP抗病机制,对毛果杨PGIP(PtPGIP)家族成员进行鉴定,以及对蛋白质理化性质和结构、系统进化、基因表达模式进行分析。结果表明,毛果杨基因组中鉴定到4个PtPGIP基因,其中,PtPGIP1和PtPGI2位于6号染色体串联重复,PtPGIP3和PtPGIP4位于16号染色体串联重复;PtPGIP1是假基因,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4具有完整的PGIP蛋白结构域。PtPGIP均为疏水蛋白,具有良好的脂溶性,且具有3～7个N-糖基化位点。亚细胞定位预测表明,其可能定位于细胞外。除PtPGIP1以外,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4蛋白均包含10个LRR片段,LRR中的保守序列xxLxLxx及蛋白质分子对接均表现出差异性。PtPGIP基因的表达具有组织特异性,PtPGIP1基因在各个组织部位的表达水平均较低...     

小麦内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白N端序列测定及分析

单子叶植物小麦内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）经分离纯化和电印迹后，进行了N端序列了测定，结果为：Lys-Pro-Len-Leu-Thr-Lys-Ile-Thr-Lys-Gly-Ala-Ser-Thr。已知的PGIP均属于双子叶植物，这些双子叶植物PGIPN端氨基酸序列同源性为36%，包括小麦PGIP的所有单、双子叶植物PGIN N端氨基酸序列同源性降低到9%。     

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白研究进展

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种特异性结合并抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶活性的细胞壁结合蛋白,迄今已在20多种植物体内发现了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白。综述了国内外近几年有关PGIP基因研究、PGIP在植物抗病中的作用以及在抗病育种中应用的研究成果。     

PGIP在作物抗病育种中的研究进展

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)是一种能特异性结合和抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)活性的细胞壁结合蛋白,国内外已在多种单双子叶植物中发现了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白,并对其作了相关研究。着重从PG IP基因的研究、PG IP的抗病机理、PG IP在抗病育种中的应用以及存在问题等几个方面加以论述。     

参与植物防御反应的LRR型蛋白结构与功能

植物含有多种富含亮氨酸重复（LRRs）结构的蛋白质,它们在植物生长、发育和抗病反应等方面发挥着重要作用。综述了这类具有LRRs结构蛋白质家族的结构特征及其参与植物防御反应的功能。参与植物防御反应LRR型蛋白质家族包括：抗病基因编码蛋白质、类受体蛋白激酶、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白和伸展蛋白家族。这四大蛋白质家族成员主要通过LRRs结构识别并结合病原物蛋白质,参与抗病信号传递,诱导植物防卫基因的表达,使植物获得系统抗性。其中LRRs序列中氨基酸的不同和单位重复数目的差异决定了蛋白识别的特异性和结合能力。     

真菌多聚半乳糖醛酸酶的研究进展

真菌多聚半乳糖醛酸酶是植物细胞壁果胶的主要降解酶之一,是植物病原真菌的重要致病因子.综述了多聚半乳糖醛酸酶的特性、多聚半乳糖醛酸酶基因及其特征、多聚半乳糖醛酸酶的分子进化、多聚半乳糖醛酸酶的表达调控及其在真菌致病过程中的作用.     

芜菁花粉发育相关基因BcMF2r的分子克隆及其生物信息学分析

根据白菜花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF2的全长序列设计引物,通过PCR直接扩增的方法从'温州盘菜'芜菁(Brassica campestris L. spp. rapifera cv. Wenzhoupancai)中克隆到了BcMF2的同源基因,命名为BcMF2r.经与白菜BcMF2基因序列比较,DNA全长序列相似性高达90%.Blast搜索结果表明,BcMF2r与拟南芥外切多聚半乳糖醛酸酶在氨基酸水平的的相似性为87%,推测BcMF2r属于多聚半乳糖醛酸酶基因.BcMF2r基因最大开放阅读框为1263 bp,编码420个氨基酸序列,编码的蛋白质分子量为43.8 kDa,等电点为8.108;碱性氨基酸(K, R) 36个;酸性氨基酸(D, E) 32个;疏水氨基酸(A, I, L, F, W, V)152个;极性氨基酸(N, C, Q, S, T, Y)113个.推导的氨基酸序列通过Prosite数据库查询,发现该序列包括3个N-糖基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,6个酪蛋白激酶II磷酸化位点,12个N-豆蔻酰化位点, 1个多聚半乳糖醛酸酶活性位点(257RVTCGPGHGLSVGS)等.通过PROFsec预测BcMF2r蛋白质的二级结构,表明该蛋白含7.86% helix,46.90% sheet和45.24% loop.将BcMF2r基因氨基酸序列与数据库中的其他植物PG序列进行同源序列比对,构建系统进化树,发现该基因具有所有PG基因特有的4个保守结构域,并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类,进一步证明了该基因可能是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因,在花粉萌发和花粉管伸长中起作用.     

葡萄砧木‘5BB’PGIP基因的克隆及生物信息学分析

以葡萄砧木品种‘5BB’(Vitis berlandieri×V.riparia)为试材,通过设计特异引物、PCR扩增,从‘5BB’基因组中得到1条全长1002 bp的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PG IP)基因序列,该序列包含1个完整的开放阅读框,与欧洲葡萄、其它果树的相应序列同源性分别为99%和68%,其推导的蛋白质序列中包含一段亮氨酸重复序列,第1~27个氨基酸残基是信号肽,三级结构与菜豆PG IP相似。     

香蕉多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的分离与纯化

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)能够特异性结合并抑制真菌侵染所产生的多聚半乳糖醛酸酶.本试验以健康香蕉幼苗植株为材料,通过硫酸铵沉淀、PM10膜超滤浓缩、亲和层析、离子交换层析以及凝胶层析等步骤,纯化获得一种PGIP,SDS-PAGE确定其分子质量为38.2 ku.该PGIP的活性对温度敏感,对香蕉枯萎病菌4号小种...     

伪狂犬病毒Fa株gB、gC、gD基因的克隆与序列分析

对猪伪狂犬病病毒闽A株(Fa株)gB、gC、gD基因进行了克隆和序列测定,结果表明:gB、gC、gD基因序列全长分别为2 745 bp、1464 bp、1 215 bp,编码914、487、404个氨基酸残基组成的多肽。序列分析结果显示:Fa株与其他毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的同源性为94.9%~99.9%,氨基酸序列的同源性为91.4%~99.9%。不同PRV毒株gB、gC、gD基因在核苷酸和氨基酸水平上高度保守。基于gB、gC、gD基因的进化树分析表明,中国分离毒株与韩国分离毒株可归为一个进化分支,而日本分离株与欧美分离株归为另一个分支。在前一个分支里,闽A株与鄂A株的亲缘关系特别近,3个基因的同源率均在99.5%以上。在gB蛋白氨基酸序列全长上中国分离株(Ea株、Fa株)比欧美分离株多了1个氨基酸,氨基酸残基的突变主要集中在第50~100氨基酸。在gC基因序列第186~211 bp,Ea株、Fa株比欧美分离株多插入了21个碱基。在gD蛋白氨基酸序列全长上,Ea株、Fa株比其他分离株多了2~6个氨基酸。在gD基因序列第803~837 bp,Fa株核苷酸AGGCCC串联重复最多,达到7个。     

鲈鱼白细胞介素-8 cDNA序列的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法扩增和克隆了鲈鱼白细胞介素-8(LjIL-8)的编码阅读框。该编码阅读框由300个核苷酸组成,编码由99个氨基酸组成前体蛋白。LjIL-8氨基酸序列与哺乳动物和鱼类IL-8类似物的氨基酸同源性分别为23%~48%和25%~92%。氨基酸序列分析表明,N端存在一长23个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。分子进化分析表明,LjIL-8与欧洲鲈鱼的亲缘关系最近。将LjIL-8编码序列克隆到原核表达载体pET-28a (+),转化E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,预期分子量大小的小分子蛋白在大肠杆菌中成功表达,Western-blotting检测结果显示,目的蛋白能与抗6×His单克隆抗体发生特异性反应。     

紫苏4-羟苯基丙酮酸双加氧酶基因 片段的克隆及表达分析

为获得紫苏迷迭香酸合成途径旁路中的4-羟苯基丙酮酸双加氧酶（HPPD）基因,采用同源克隆的方法, 根据已报道的其他植物的HPPD 基因序列设计合成简并引物,克隆得到紫苏HPPD 基因片段,命名为PerHPPD-1, 该片段长663 bp,编码221 个氨基酸。通过氨基酸比对分析发现,其氨基酸序列与丹参和彩叶草的HPPD 基因片段 一致性分别为66.36%和77.93%,系统进化树分析又进一步表明该片段与唇形科植物的亲缘关系最近。荧光实时定 量PCR 检测结果显示,PerHPPD-1 基因在紫苏根、茎、叶中均有表达,在叶中表达量最高,其次为茎、根。激素（赤霉 素、茉莉酸甲酯、脱落酸）处理可在一定程度上上调PerHPPD-1 在叶中的表达水平。     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

瓦氏黄颡鱼肝脂酶基因cDNA序列的克隆与序列分析

利用RT-PCR方法克隆瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)肝脂酶cDNA序列片段,并对其基因结构和系统进化关系进行分析.瓦氏黄颡鱼肝脂酶cDNA片段长1065 bp,编码353个氨基酸.肝脂酶氨基酸序列同源性分析结果表明,瓦氏黄颡鱼与其他鱼类的同源性为62%-100%.瓦氏黄颡鱼肝脂酶氨基酸残基包含糖基化位点、催化位点、催化中心三联体位点、脂质结合位点和多肽"盖"等主要结构区域.系统进化树分析表明,瓦氏黄颡鱼肝脂酶与草鱼、鳙、斑马鱼肝脂酶聚为一支.因此,瓦氏黄颡鱼的肝脂酶在鱼类进化中较为保守.     

枇杷质膜水孔蛋白基因EjPIP1的克隆及AM真菌对其表达的影响

【目的】克隆‘早钟6号’枇杷（Eriobotrya japonica ‘Zaozhong 6’）的一个质膜水孔蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）基因,分析其序列特征,研究接种丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal,AM）真菌对枇杷水分利用效率（water use efficiency,WUE）及对质膜水孔蛋白基因表达模式的影响。【方法】以‘早钟6号’枇杷实生苗为材料,通过盆栽试验,设置2个处理（AM和NM）,5个重复,利用光合测定系统对叶片水平上水分利用效率进行测定;采用RT-PCR和RACE技术克隆该基因的cDNA全长,结合生物信息学软件对其序列特征进行分析,利用实时荧光定量PCR（Real time-PCR）分析接种AM真菌后该基因在枇杷叶片和根中的表达模式。【结果】在有效的光合同化时间（7：00-17：00）内,接种AM真菌显著的提高了枇杷的水分利用效率。克隆得到枇杷质膜水孔蛋白基因EjPIP1（GenBank登录号：JX041627）,cDNA全长为1 142 bp,编码区含861 bp,共编码286个氨基酸。氨基酸序列分析表明,EjPIP1具有水孔蛋白家族高度保守的2个NPA（Asn-Pro-Ala,天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）基序。同源性分析显示,枇杷EjPIP1氨基酸序列与已报道的苹果（Malus domestica）、桃（Prunus persica）和智利草莓（Fragaria chiloensis）等高等植物的氨基酸序列同源性很高,分别为97%、92%和90%。Real time-PCR分析结果证实,EjPIP1在枇杷叶片和根中均有表达,并且叶片中的相对表达量略高于根中。正常供水条件下,接种AM真菌后,该基因在根中表达上调,在叶片中表达下调。【结论】接种AM真菌提高了‘早钟6号’枇杷叶片水平上水分利用效率。从枇杷叶片中克隆得到了一个质膜水孔蛋白类的基因EjPIP1,实时荧光定量PCR分析表明该基因在枇杷叶片和根中表达受AM真菌的影响,该基因的表达模式有利于提高AM植株的水分利用效率。     

龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（DLCCoAOMT）基因的克隆和表达分析

【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR 研究DLCCoAOMT 基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT 基因,GenBank 登录号为JN093023。该cDNA 全长993 bp,具有1 个744 bp 的完整开放阅读框（ORF）,编码247 个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT 编码的氨基酸序列与其它植物的 CCoAOMT 蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,龙眼 DLCCoAOMT 与桦木属的CCoAOMT 蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量技术进行组织表达模式分析发现,DLCCoAOMT 基因在根、茎、叶中均有表达。总体上表达量在根和茎中较多,叶中较少,随着低温胁迫时间延长,DLCCoAOMT 基因在各组织的表达量也发生变化。原核表达结果表明,DLCCoAOMT 基因在大肠杆菌中获得表达。【结论】从龙眼中克隆到咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因,该基因可能参与调控低温胁迫。     

草鱼hepcidin基因cDNA克隆、序列分析与表达

运用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplication ofcDNA Ends,RACE)技术获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)hepcidin基因全长cDNA,为774 bp,包括ORF 282 bp、5’UTR 117 bp和3’UTR 383 bp,3’UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和1个mRNA不稳定基序(ATTTA)。推定编码93个氨基酸,与其它鱼类hepcidin的序列同一性为27.9%～51.6%;SignalP 4.0软件预测信号肽位于1～24位。在邻接(neighbor-joining,NJ)法构建的系统进化树中,草鱼hepcidin前体肽和其他已报导的鱼类hepcidin前体肽聚为一枝。实时定量PCR(quantitative real-time polymerasechain reaction,qPCR)检测结果显示hepcidin基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和眼等组织;柱状黄杆菌注射后4～48 h,hepcidin基因在肝脏、脾脏和头肾中表达均显著上调。研究亮点:克隆到草鱼抗菌肽hepcidin一个新基因的全长cDNA,阐明了其所编码的hepcidin与其它脊椎动物hepcidin具有类似的结构与功能;证明其广泛分布于各组织中,参与了对细菌的免疫应答,是固有免疫的重要组成部分。     

猪戊型肝炎病毒新疆株swCH25全基因序列的分析

 设计18对PCR引物分片段扩增猪戊型肝炎病毒新疆分离株swCH25全基因，对两末端采用末端快速扩增方法（RACE）进行扩增，扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序。用DNAstar软件进行序列同源性分析，PHYLIP软件绘制基因进化树，在全基因序列的基础上比较猪HEV与其它HEV基因型的差异和人源HEV的关系。结果显示swCH25全序列除去3′poly（A）尾，由7 243个核苷酸组成，ORF 1～3分别编码含1070，674和114个氨基酸的蛋白质。全基因序列与HEVⅠ、Ⅱ和Ⅲ型同源性73.5%～75.7%，与Ⅳ型的同源性为83.5%～89.8%，其中与Ⅳ型中国人源T1株最高，达89.8%。ORF1与Ⅰ～Ⅲ和Ⅳ型的核苷酸同源性分别为71.6%～74%和82.3%～89.4%，氨基酸同源性为80.7%～86.1%和94.3%～96.0%；ORF2与Ⅰ～Ⅲ和Ⅳ型的核苷酸同源性分别为78.4%～81.3%和87.1%～90.9%，氨基酸同源性为89.7%～93.8%和97.2%～98.2%；ORF3与Ⅰ～Ⅲ和Ⅳ型的核苷酸同源性分别为84.4%～87.3%和95.4%～96.8%，氨基酸同源性为74.8%～83.2%和93.8%～97.4%,基因进化树显示swCH25与基因Ⅳ型人源T1株最接近，在同一分支上。swCH25株是国内第一个测出全基因序列的猪戊型肝炎病毒。     

鹅神经肽Y基因的克隆及生物信息学分析

克隆出鹅NPY基因并对序列进行分析。根据鸡NPY基因核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法获得了鹅NPY基因的编码序列,并用相关软件及在线分析方法对其核苷酸及氨基酸序列进行分析。结果表明,鹅NPY基因长度为371 bp,包含294 bp整个开放阅读框,共编码97个氨基酸,其分子量预测值为11.083 kD,等电点为(pI)为5.76。鹅NPY基因核苷酸序列与禽类和哺乳动物的序列同源性分别为96%~97%、86%~88%。氨基酸进化树分析发现NPY基因具有种间多样性,鹅NPY与其他禽类处于同一分支。成功克隆鹅NPY基因CDS序列并对其进行了生物信息学分析,为深入研究其功能奠定基础。