稻瘟病菌原生质体的制备和再生菌株的致病性

以稻瘟病（Ｍａｇｎａｒｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）菌株ＺＡ４９、１３１为供试菌株,进行原生质体的制备试验。结果表明：用９种酶均能消化该菌细胞壁,并获得一定数量的原生质体;产生原生质体效率最高的是酶Ｎｏｖｏｚｙｍ ＾ＴＭ２３４和Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ,且这两种酶以１０ｍｇ／ｍｌ浓度产生的原生质体数量最多,消化２￣３ｈ后即可获得相当数量的原生质体,最适作用温度分别为３０℃和３２℃。以几丁质降解酶与Ｎｏｖｏｚｙｍ ＾ＴＭ２３４或Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ混且时对制备原生质体有很好的增效作用。作用认为,Ｎｏｖｏｚｙｍ ＾ＴＭ２３４和Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ的作用浓度以５ｍｇ／ｍｌ最为经济、实用。所制备的原生质体均能再生菌丝和具有产生与原菌株相同致病性分生孢子的能力。     

水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化

为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。     

水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)原生质体制备与再生技术及优化

水稻纹枯病的病原菌是立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn),其病原菌(R.solani Kühn)又称为水稻纹枯病(rice sheath blight)菌,由立枯丝核菌侵染引起的水稻纹枯病是水稻上最重要的病害之一。为建立高效的水稻纹枯病菌原生质体制备技术体系,采用0.7mol/L NaCl作为渗透稳定剂,对Glucanex、溶壁酶(lywallzyme)、纤维素酶(cellulase-R-10)、离析酶(macerozyme-R-10)、蜗牛酶(snailase)、崩溃酶(driselase)和裂解酶(lysing enzyme)等7种不同的胞壁裂解酶降解水稻纹枯病菌GD-118菌株细胞壁的作用进行测定,并对不同酶组合及其酶质量浓度进行优化筛选。结果显示:Glucanex对水稻纹枯病菌细胞壁的降解效果最好,用20mg/mL Glucanex处理1g菌丝4h后,可释放118.5×104个原生质体;用15mg/mL Glucanex和10mg/mL lywallzyme混合酶处理,可高效降解水稻纹枯病菌细胞壁并获得大量原生质体,原生质体产量达3.09×107个/g菌丝,再生率达58%;Glucanex和lywallzyme的混合酶对不同水稻纹枯病菌菌株的细胞壁降解和原生质体释放没有显著差异。可见,上述制备水稻纹枯病菌原生质体的方法具有较好的高效性和适用性,可满足该菌分子遗传研究的需要。     

河南麦区小麦纹枯病菌致病性分化与多样性研究

[目的]研究河南麦区小麦纹枯病菌的组成和致病性分化现象。[方法]以豫麦49和豫麦9023为试材,进行小麦纹枯病菌的分离、小麦纹枯病菌细胞核计数、纹枯病菌生长速度比较及致病性测定试验。[结果]从河南省32个县(区)麦田病株中分离出57株小麦纹枯病菌,经过细胞核染色后发现,其中包括48个双核菌株,占84.21%,9个多核菌株,占15.79%。分别测定了57株小麦纹枯病菌对2个小麦品种豫麦49和豫麦9023的致病性,发现不同来源的菌株致病性差异明显。通过比较不同来源纹枯病菌在2种固体培养基上的生长状况发现,纹枯病菌株之间生长速度存在明显差异。[结论]河南麦区的小麦纹枯病菌主要是禾谷丝核菌,其次是立枯丝核菌。不同来源的小麦纹枯病菌存在显著致病性分化现象。     

大豆疫霉菌原生质体制备及再生菌株的生物学性状

为了建立聚乙二醇(PEG)介导的大豆疫霉菌的遗传转化系统,对大豆疫霉菌原生质体的制备条件及再生菌株的生物学性状进行了研究.结果表明:Driselase以及Driselase和Lysing酶的混合液均能有效地裂解菌株Pmg 2-3的细胞壁并获得原生质体;其中混合酶液的裂解效果优于Driselase单一酶液,当混合酶液中两个酶的浓度均为15 mg·mL-1时,在30℃消化3 h可产生4×106mL-1的原生质体.所制备的原生质体经细胞核染料4,6-diamidino-2-phenyl-indole(DAPI)染色后发现,大型均一的原生质体内含有细胞核;原生质体在再生培养基上再生率达1.0%,再生菌株在利马豆培养基上菌落形态呈白色、圆形、毛毡状,其生长速率、致病性均与亲本菌株保持一致.     

大豆疫霉菌原生质体制备及再生菌株的生物学性状

为了建立聚乙二醇(PEG)介导的大豆疫霉菌的遗传转化系统,对大豆疫霉菌原生质体的制备条件及再生菌株的生物学性状进行了研究。结果表明:D riselase以及D riselase和Lysing酶的混合液均能有效地裂解菌株Pmg 2-3的细胞壁并获得原生质体;其中混合酶液的裂解效果优于D riselase单一酶液,当混合酶液中两个酶的浓度均为15 mg.mL-1时,在30℃消化3 h可产生4×106mL-1的原生质体。所制备的原生质体经细胞核染料4,6-d iam id ino-2-phenyl-indole(DAPI)染色后发现,大型均一的原生质体内含有细胞核;原生质体在再生培养基上再生率达1.0%,再生菌株在利马豆培养基上菌落形态呈白色、圆形、毛毡状,其生长速率、致病性均与亲本菌株保持一致。     

水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani AG1 IA）原生质体的制备和再生

 由于立枯丝核菌不产生无性孢子,为研究纹枯菌的致病机制带来了障碍,但可以通过制备纹枯菌的原生质体,利用根癌农杆菌介导转化的方法,建立突变体库,为后续研究打下基础。试验利用Lysing enzyme（from Trichoderma harzianum）裂解水稻纹枯病菌获得原生质体,通过摸索纹枯病菌的菌龄、裂解时间、裂解液的pH值3个重要因素,得到水稻纹枯病菌原生质体的最佳制备和再生条件,并且在细胞壁再生实验中,改进细胞壁再生的培养方式,最终制得原生质体,并成功使其再生。     

河南省小麦纹枯病菌原及其致病性研究

1 998～ 2 0 0 0年 ,从河南省各地采集有明显症状的小麦纹枯病标样 ,从中分离出 2 5 1个丝核菌 (Rhizoctonia)菌株 ,其中 1 98株为禾谷丝核菌 (Rhizoctoniaceralis) ,占 78.9% ;5 3株为立枯丝核菌 (R .solani) ,占 2 1 .1 %。对 62个菌株的致病性测定结果表明 ,禾谷丝核菌和立枯丝核菌的致病力无显著差异 ,不同地区菌株的致病力亦没有明显差异 ,不同小麦品种对纹枯病菌的抗性显著不同。     

小单孢菌40027菌株原生质体的形成和再生

通过酶解温度、酶解时间和再生培养基对小单孢菌40027菌株原生质体形成和再生的研究,确定小单孢菌40027菌株原生质体制备条件为37℃酶解60min;原生质体的再生培养基为R-1培养基。     

7种除草剂对小麦纹枯病菌生长及致病力的影响

利用麦田常用的骠马、丁草胺、使它隆、麦乐宁、亿力、百草敌和麦草宁7种除草剂,探讨其对小麦纹枯病菌菌丝生长的抑制作用及致病力的影响。结果表明:骠马、丁草胺、使它隆、麦乐宁、亿力、百草敌和麦草宁的EC50分别为7.03、26.38、67.20、88.05、199.35、1 249.55和203.31 m g.L-1。在50 m g.L-1浓度下,对菌核数的抑制率分别为86.3%、57.8%、74.5%、73.5%、71.6%、55.9%和63.7%;对小麦纹枯病菌侵染力的抑制率分别为44.83%、25.00%、14.66%、-1.00%、31.03%、35.34%和25.86%。显微镜观察表明:经除草剂处理后,菌丝细胞形态均发生不同程度的异常变化,骠马可延迟菌丝侵入叶鞘细胞的时间,并影响菌丝向邻近细胞扩展。     

禾谷丝核菌的次生代谢产物

禾谷丝核菌 (RhizoctoniacerealisVanderHoeven)菌株对小麦的致病性测定结果表明 ,3个菌株的致病力存在显著差异。小麦品种和禾谷丝核菌菌株间存在显著的相互作用 ,在两个感病品种“苏麦 3号”、“宁麦 6号”和R7、R4 6 两个强致病力菌株间 ,这种相互作用尤为明显。禾谷丝核菌在马铃薯蔗糖培养液中产生的次生代谢物种类多 ,产量高。试验明确了进行禾谷丝核菌次生代谢物分析的最佳液相色谱条件。液相色谱和气质联用的结果显示 ,致病力不同的 3个菌株间 ,次生代谢物的构成上有差异 ,呋喃甲酸和苯甲酸衍生物的产量在菌株间差异最大。禾谷丝核菌的酸性粗提物具一定的生物活性 ,在高浓度和低浓度下的作用相反。禾谷丝核菌的次生代谢物处理后 ,小麦组织的电导率与对照 (未处理 )没有差异 ,表明次生代谢物对小麦的细胞膜半渗透性可能没有影响     

小麦纹枯病综防技术区域性决策的初步研究

运用决策分析方法, 研究了在区域性生产条件和小麦不同抗性品种布局的情况下, 如何优化综合防治技术, 以达到控害增效的目的, 为因地制宜综合防治小麦纹枯病提供了一种基于决策分析理论的技术方法途径。     

生防细菌B296·B253对小麦纹枯病防病效果的研究

[目的]研究生防细菌B296、B253对小麦纹枯病的防病效果。[方法]从土壤中筛选2株生防细菌(B296和B253),研究其对小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的生物活性,并对其防病效果进行分析。[结过]结果表明,生防细菌B296、B253对小麦纹枯病菌的抑菌率分别达85.9%和83.8%。在灭菌土中,生防菌的防效要明显高于自然土中的防效,B296达57.96%,B253达69.43%。生防菌B296和B253田间试验防效分别为55.16%和37.05%。[结论]该研究为小麦纹枯病的防治提供理论依据。     

小麦纹枯病菌拮抗细菌的稳定性及对小麦纹枯病菌致病作用的影响

从江苏省51个市(县)采集的550余份小麦纹枯病病叶鞘上共分离获得441个细菌分离物,其中35个菌株对小麦纹枯病菌产生了拮抗作用,占总菌株数的7.94%。经300 d转代保存后仍有28株菌保持了对小麦纹枯病菌的拮抗或抑制作用。拮抗细菌与纹枯菌混合接种小麦,对纹枯菌的侵染有抑制作用,其中GC4菌株对纹枯病的抑制率达63%。     

应用real-time PCR定量检测土壤中小麦纹枯病菌方法的建立

根据小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis AG-D融合群ITS区的DNA序列设计特异性引物对WKF-8/WKR-8,对引物的特异性和灵敏性进行检测,建立并优化基于SYBR GreenⅠ荧光染料法的real-time PCR反应体系,绘制标准曲线。检测范围在1.0×10-3~10 ng/μl之间有良好的线性关系,相关系数R2为0.995,扩增效率为99.7%,灵敏度比常规PCR方法高100倍。结果表明,该方法具有快速、特异性强、敏感度高等特点。     

禾谷丝核菌拮抗真菌的鉴定及抗菌活性研究

利用从小麦茎叶组织中分离的内生真菌,进行平板对峙试验,从中筛选出2株对禾谷丝核菌有明显抑制效果的菌株(RF5和RF6)。采用改良的真菌基因组DNA提取方法,提取内生真菌RF5和RF6的基因组DNA,运用ITS序列通用引物(ITS4、ITS5)进行扩增,分别得到约600 bp的特异条带。对PCR产物进行测序,根据序列比对分析结果,将拮抗真菌RF5和RF6分别鉴定为:肉座菌(Hypoc-reales sp.)和杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。进一步研究这2株拮抗真菌的抗菌活性大小,结果显示,2株真菌对病原菌都能产生明显的抑菌圈,抑菌圈直径分别为23 mm和19 mm;其液体发酵产物对病原菌的生长也有显著抑制作用,抑制率分别为63.3%和60.8%。     

SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的SYBR Green I实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（R. solani）、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）和禾谷镰孢（F. graminearum）等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝DNA进行普通PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强,普通PCR检测结果仅小麦纹枯病菌DNA有扩增条带。Real-time检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰,对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通PCR检测的灵敏度为6.5×10³ copies/μL, real-time PCR的灵敏度可达到6.5×10² copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.997,扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行real-time PCR检测,结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于real-time PCR技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。