兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2糖蛋白主要抗原域的原核表达及纯化

本实验利用PCR方法从pUC18-E2上扩增出E2基因的主要抗原域片段,长为601 bp,将该PCR产物克隆到原核表达载体pET32a上,得到pET32a-e2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,目的蛋白以包涵体形式表达,其分子量42KD左右;Ni亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blot检测.pET32a-e2重组子的构建及蛋白表达与纯化为进一步制备多克隆抗体或单克隆抗体打下了基础.     

抗真菌KP4蛋白的原核表达载体构建与表达

为制备KP4的多克隆抗体,将KP4编码框克隆到pMD19-T中,载体经测序后,亚克隆到原核表达载体pET32a中,获得了KP4的原核表达载体PET-KP4.将构建成功的KP4原核表达载体转化宿主菌BL21( DE3)并用IPTG对重组菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析诱导后重组菌的总蛋白显示,融合蛋白大小约为31 ku,以包涵体形式存在;对融合蛋白的表达条件进行了优化,KP4大量表达最佳培养温度为37℃,诱导剂IPTG的最佳浓度为1.0 mmol/L,最佳诱导培养时间为8h;对目标蛋白进行包涵体破碎,用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析对总蛋白进行了纯化.SDS-PAGE电泳分析与蛋白浓度测定结果显示,目的蛋白纯度好,浓度达到了236μg/mL.     

西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。     

BLCAP蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的:利用原核表达系统表达BLCAP融合蛋白并制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a( )-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达并采用亲和层析的方法纯化和SDS-PAGE鉴定后免疫日本大耳白兔,制备BLCAP蛋白多克隆抗体并检测其特异性。结果:经过IPTG诱导,获得分子量大小约为28ku的融合蛋白,用纯化得到的融合蛋白免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP蛋白的多克隆抗体,通过Western blot检测证明该抗体能够与BLCAP融合蛋白发生特异性结合。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性,制备的抗BLCAP的多克隆抗体特异性较好,为今后进一步研究BLCAP蛋白性质与功能奠定了基础。     

康氏木霉HEX1蛋白的原核表达及纯化

【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功表达及纯化,获得了分子质量约为25ku的重组蛋白。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体的制备

为了评价牛坏死杆菌外膜蛋白43K OMP的免疫原性,试验利用大肠杆菌原核表达系统对牛坏死杆菌43K OMP基因进行表达,纯化目的蛋白免疫兔,制备牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体,并对其进行鉴定。对基因序列进行预测分析后,针对大肠杆菌稀有密码子优化合成该基因序列,克隆至pET-32a原核表达载体上,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达及镍柱进行纯化,获得重组蛋白大小约为59 ku。重组蛋白经Western blotting鉴定后免疫兔,制备多克隆抗体。Western blot检测牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体与43K OMP重组蛋白具有很好的免疫原性。研究成功制备了牛坏死杆菌43K OMP多克隆抗体,为以43K OMP蛋白为基础的疫苗研究奠定基础。     

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。     

Virus Location and Lymphocyte Apoptosis in Lymph Nodes of Piglets Infected with PCV-2

The present study has been performed to understand the location of the virus, type of apoptotic cells, and their relation to lymph nodes of piglets infected with porcine circovirus type Ⅱ （PCV-2）. Nine 32-day-old conventional piglets free of infection with PCV-2 were used, and distributed into three groups： control group （n = 3）, piglets inoculated with PCV-2 alone （PCV-2, n = 3）, and PCV-2 inoculated and KLH immunostimulated group （PCV-2 ＋ KLH, n = 3）. Superficial inguinal lymph nodes from all piglets were collected for histological examination after 32 days postinoculation, and immunohistochemistry for PCV-2 detection. Location of apoptotic cells was detected with TdT-mediated dUTP nick end labeling （TUNEL） and cell cycle, and the apoptotic rates were measured by flow cytometry. The characteristic histopathological lesions of the piglets in PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH were lymphocyte depletions in the cortex and paracortex of the lymph nodes, epithelioid-like macrophage infiltration, and intracytoplasmic inclusion bodies presented in epithelioid-like macrophages. PCV-2 was mainly found in epithelioid-like macrophages by immunohistochemistry. In the lymph nodes, lymphocytes presented higher apoptotic rates in the cortex by TUNEL, special B-cell areas, and similar apoptotic cells were found in this compartment in the control. The apoptotic rates of the lymph nodes were 0.41, 3.34, and 4.88% in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH groups by flow cytometry, respectively. The apoptotic rates of lymph nodes for PCV-2 and PCV-2 ＋ KLH piglets were significantly higher than those for the control group （P〈0.05 and P〈0.01）. The proliferation index （PI） was 0.17_＋0.01, 0.12_＋0.01 and 0.12_＋0.04 in the control, PCV-2, and PCV-2 ＋ KLH group, the PI of the control group was higher than that of the other groups, but without the statistical difference. PCV-2 can induce lymphocyte depletion in lymph nodes of piglets by blocking cell proliferation and promoting apoptosis. This is one o     

不同温度LED光萎凋对铁观音MEP上游关键基因和香气的影响

【目的】萜类化合物是乌龙茶挥发性芳香物质的重要组分,2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径（MEP）上游关键基因直接参与调控萜类化合物前体物质的合成。而乌龙茶香气的形成与萎凋工序密切相关,光照和温度是影响萎凋的重要因子,探讨LED光与温度在乌龙茶萎凋过程中对香气的影响,为提高乌龙茶萎凋叶香气品质提供参考。【方法】基于转录组数据,根据KEGG筛选出响应光照的MEP上游关键基因（DXS、DXR、HDS、HDR）。对一芽三叶铁观音鲜叶进行LED白光和不同温度（20℃（L20）、25℃（L25）、30℃（L30）、35℃（L35）和40℃（L40））萎凋处理,黑暗下温度（20℃（D20）、25℃（D25）、30℃（D30）、35℃（D35）和40℃（D40））萎凋处理;分别测定铁观音萎凋叶的香气组分和MEP上游关键基因的相对表达量。【结果】L30处理萎凋叶各基因表达量达到最大值,萜类基因（DXS、DXR、HDS、HDR）表达量分别为XY组（对照）的4.31、5.28、11.77、1.59倍,为D30处理的2.24、2.39、1.86和1.60倍。D30组各基因表达量为黑暗处理组最大,依次为XY组的1.92、2.21、6.34和0.99倍。L20处理萎凋叶的α-法呢烯芳樟醇氧化物（I、II）含量最高,较XY依次提高了15.05%、4.92%和15.13%;L30处理萎凋叶的橙花叔醇、芳樟醇和香叶醇含量最高,较XY组依次提高了3.71%、6.14%和15.28%;LED组铁观音萎凋叶主要香气组分含量均高于相对应的温度处理组。通过主成分分析法建立数学模型,对萎凋叶香气组分进行评估,得出L20组萎凋叶得分最高,L30组萎凋叶次之;与香气分析得出结果一致。【结论】铁观音萎凋叶基因表达量与香气含量的变化趋势不存在同步性;L30处理萎凋叶基因表达量、主要萜类香气物质含量和主成分分析得分均较高,这与铁观音生产上的萎凋温度相一致。萎凋温度过高（40℃）不利于萎凋叶萜类关键基因的表达和萜类化合物的形成。     

丙草胺与4种磺酰脲类除草剂混用对稻苗安全性的影响

室内测定了丙草胺分别与磺酰脲类除草剂甲磺隆、苄嘧磺隆、醚磺隆和吡嘧磺隆混用后，一叶一心期稻苗抑制50％株高的使用浓度(IC50)和抑制10％株高的使用浓度(IC50)，并用共害系数(CHC)对混用组合安全性的联合作用进行了评价．结果表明：所有混配处理的CHC10均小于12．0，表现出强烈的解毒效应；不同混用处理的CHC50值差异很大，丙草胺与甲磺隆混用的CHC50均小于25．0，解毒效应显著．丙草胺与苄嘧磺隆混配的CHC50为26．1—167．8，丙草胺与苄嘧磺隆混用的CHC50为52.2—115.5，丙草胺与醚磺隆混用的CHC50为80．0—110．2．     

不同阶段肉仔鸡能量需要模型的建立

试验研究了0~8周龄肉仔鸡胴体与羽毛蛋白、脂肪的生长曲线及0~3、4~6和7~8周龄3个阶段每日摄入不同水平的能量及蛋白对其体蛋白、体脂肪沉积的影响,旨在确定胴体与羽毛蛋白、脂肪动态的沉积规律及日粮能量沉积为体蛋白及体脂肪的效率。试验1,包括3个饲养试验分别选取体重相近的0、21和42日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡324只,按性别及日粮随机分为18个处理,每处理3个重复,每重复6只鸡。肉仔鸡每日限量饲喂,饲喂水平分别为正常采食量的90%、70%和50%,每日定量供给肉仔鸡高、中、低3个水平的高蛋白质基础日粮及由饲喂水平决定的定量淀粉,进而使肉仔鸡每日采食能蛋质量比(代谢能/粗蛋白)不同的9种日粮;试验2,选取体重相近的0日龄AA肉仔鸡144只,按性别不同随机分为2个处理,每处理4个重复,每重复18只鸡。试验初和试验末分别进行屠宰,以测定肉仔鸡胴体和羽毛蛋白、脂肪和干物质含量。结果显示:1)Gompertz方程能很好的拟合不同性别肉仔鸡蛋白和脂肪的生长,不同性别间蛋白和脂肪极限重量、羽毛蛋白和脂肪的生长速率差异显著(P<0.05),而胴体蛋白和脂肪的生长速率差异不显著(P>0.05)。2)在0~3、4~6和7~8周...     

ICP-OES法同时测定果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡含量

果蔬样品经混酸消化后,控制一定的酸度,定容后应用等离子体发射光谱法(ICP-OES)对果蔬中铅、砷、镉、铬、铜、锡六种有害重金属进行测定,研究了分析测定条件,方法简单快速。测定结果表明,五种元素的加标平均回收率在91.0%~107%之间。其RSD均小于3.5%。按该方法进行处理及测定铅、砷、镉、铬、铜、锡,在选择的测定条件下最低检出限分别为0.0006 mg/kg、0.0003 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.00005 mg/kg、0.00003 mg/kg、0.0006 mg/kg。     

夹竹桃目植物新资料

本文根据国内外模式标本和文献资料,将亚洲、美洲和大洋洲夹竹桃目植物进行了部分整理和研究,对该目夹竹桃科和萝摩科18属37种作了订正,其中有11种分布新记录,17个新异名,建立15个新名称和1个新组合.     

氮、磷、钾、硼肥施用对甘蓝型杂交油菜产量及经济效益的影响

 【目的】指导当前生产条件下江西油菜测土配方施肥技术的推广。【方法】2008—2009年在江西省设置12个田间试验,研究氮、磷、钾和硼肥施用对甘蓝型杂交油菜产量及其相关性状的影响,并对施肥经济效益进行分析。【结果】氮磷钾硼肥配施处理(NPKB)平均产量为2 015 kg?hm-2,与不施肥相比,NPKB、缺B(NPK)、缺P(NKB)、缺K(NPB)和缺N(PKB)分别增产1 121、839、758、746和249 kg?hm-2;NPKB配施处理下各主要经济性状表现较好,有利于对N、P、K、B素的吸收利用;效益分析表明,NPKB配施效益达到5 449.5元/hm2,比不施肥增收2 231.1元/hm2,其次是缺B(NPK)、缺P(NKB)、缺K(NPB),分别比不施肥增收1 298.4、1 280.7和1 541.1元/hm2,而不施氮肥的处理减收206.1元/hm2。【结论】NPKB配施对甘蓝型杂交油菜增产、增收效果显著,是保证高效生产的技术关键。     

锌对不同基因型玉米产量及氮磷钾锌吸收与分配的影响

[目的]研究锌对不同基因型五米产量及氮磷钾锌吸收与分配的影响。[方法]以四单19和牡丹9 2种不同基因型玉米为材料,以EDTA-Zn为锌肥料,采用盆栽方法研究锌对不同基因型玉米产量及氮磷钾锌吸收与分配的影响。[结果]适量供锌可以提高玉米的穗粒数;在低锌处理下（Zn0、Zn1）各器官锌含量相差较小,随着施锌水平的提高,锌在叶片、茎秆、叶鞘中含量迅速增加,而在子粒和苞叶中增加幅度较小;玉米吸收的多余的锌主要集中在下部器官,以减轻过量的锌对植株造成的伤害。不同的供锌水平对低锌不敏感品种牡丹9氮、磷、钾的吸收与转运影响较小;相对而言,低锌敏感品种四单19氮、磷、钾的吸收与转运更易受到外界供锌量的影响。[结论]适量供锌可以提高玉米产量和对氮、钾的利用率降,低磷的吸收和利用。     

中国屏腹茧蜂属订正附二新种记述（膜翅目：茧蜂科：屏腹茧蜂亚科）

屏腹茧蜂属ｓｉｇａｌｐｈｕｓＬａｔｒｅｉｌｌｅ是茧蜂科中的一个小属，种类稀少，标本不易采到。本文对该属的中国种类作了订正研究。中国过去虽已记述过４种，但现经研究发现，其中Ｓ．ａｎｏｍｉｓＹｏｕｅｔＺｈｏｕ，１９９１和Ｓ．ｎｌｇｒｉｐｅｓＨｅｅｔＣｈｅｎ，１９９３均为Ｓ．ｈｕｎａｕｎｓＹｏｕｅｔＴｏｎｇ，１９９１的同物异名，因此，实存２种；本文另添２个新种：Ｓ．ｇｙｒｏｄｏｎｔｕｓＨｅｅｔＣｈｅｎ，ｓｐ．ｎｏｖ．和Ｓ．ｒｕｆｉａｂｄｏｍｉｎａｌｉｓＨｅｅｔＣｈｅｎ，ｓｐ．ｎｏｖ．所以，目前本属的中国种类共有４种。另外，Ｓ．ｈｕｎａｎｕｓＹｏｕｅｔＴｏｎｇ和Ｓ．ｇｙｒｏｄｏｎｔｕｓＨｅｅｔＣｈｅｎ，ｓｐ．ｎｏｖ．为本属在东洋区的首次记录。     

Characterisation of Neonicotinoid and Pymetrozine Resistance in Strains of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from China

Four strains of the Q biotype and one of the B biotype of the whitefly Bemisia tabaci collected from China were characterised for resistance to four neonicotinoid insecticides and pymetrozine. Q biotype strains showed moderate to strong resistance to imidacloprid, thiamethoxam and acetamiprid, but little or no cross-resistance to dinotefuron. Resistance to neonicotinoids was consistently associated with resistance to pymetrozine, despite the latter having a distinct (though unresolved) mode of action. The single B biotype strain proved largely susceptible to all the insecticides investigated. Resistance in the Q biotype strains was associated with over-expression of a cytochrome P450 monooxygenase gene, CYP6CM1, whose substrate specificity presumably accounts for the observed cross-resistance profiles.