Cloning and expression of nucleocapsid protein gene of TGEV HB06 strain

The nucleocapsid protein gene of transmissible gastroenteritis virus, 1 149 bp in length, was amplified by RT-PCR from isolated strain HB06 and cloned into pMD18-T. Sequence comparison with other transmissible gastroenteritis virus (TGEV) strains selected from the Gene Bank revealed that the homology of N gene complete sequence shares more than 97% in nucleotide. N gene was cloned into BamHI and EcoRI multiple cloning sites of the prokaryotic expression vector pET 20 b, and named pETN. After being induced by isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG), the recombinant nucleocapsid protein was expressed. The result of SDS-PAGE and Western-blot showed that the recombinant nucleocapsid protein was 47 kDa and had strong positive reactions with TGEV-specific antibody.     

鹅副粘病毒M基因主要抗原位点片段的原核表达及鉴定

根据GenBank中发表的GPMV SF02株M基因核苷酸序列设计合成一对引物,通过RT-PCR扩增JS/1/97/G0株M基因主要抗原位点片段M1,将其克隆入pMD18-T载体,序列测定和分析表明,所扩增的M1基因核苷酸长为444 bp,共编码148个氨基酸.将M1同载体PGEX-6P-1连接后,转化入E.coli BL21(DE3)PlysS,经IPTG诱导表达出目标蛋白,与预计相符.对表达的M1蛋白进行Western blot鉴定,表明所表达的M1蛋白可以与GPMV SF02株阳性血清发生特异性反应.     

犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其表达产物抗原性鉴定

参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA,经RT—PCR扩增得到1572bp的基因片段,将其插入pMD18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5a中,进行鉴定、测序。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸,与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93．9％～99．1％。Western-blotting分析显示表达产物为84kDa的融合蛋白,可被犬瘟热抗血清所识别,具有良好的抗原性。     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

以本实验室从河北分离到的TGEV毒株,采用RT-PCR技术扩增了TGEV N基因,长为1149bp,并进行亚克隆重组到pMD18-T质粒载体上,连接,转化,鉴定后得到阳性重组质粒．命名为pTN．将重组质粒插入的片段进行序列分析和比较,结果表明TGEV河北分离株N基因与国外的Purdue-115、FS772/70、TO14、96-1933株均具有较高的同源性,达95％以上。推导的氨基酸序列同源性为95％以上。并将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-3重组,成功构建了原核表达载体pGEX-N。pGEX-N表达载体的构建,为其蛋白质的表达提供重要依据。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的克隆及原核表达

通过PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株核衣壳蛋白(N)基因,然后将重组到pMD18-T载体中的约1174 bp的基因片段亚克隆到PET-32a( )表达载体上,通过酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒命名为PET-N,核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,将阳性重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约66 kD的融合蛋白,N基因的表达可为传染性胃肠炎病毒的诊断提供良好的物质材料。     

犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因的克隆和原核表达质粒的构建

通过设计特异性引物,以犬传染性肝炎患犬的全血基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得了犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因,将其插入到pMD18-T载体进行测序、鉴定,构建原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hex-on。结果显示,犬传染性肝炎病毒Hexon基因已被成功地克隆,基因全长2 718 bp,包含从起始密码子ATG到终止密码子TAA的完整序列。与犬传染性肝炎病毒国际标准株Hexon蛋白基因的同源性为99.7%,通过实验鉴定表明pMD18-Hexon克隆载体和原核表达质粒载体pGEX-6p-1-Hexon已成功构建。     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF3 T淋巴细胞抗原表位的克隆与原核表达

根据Stevenson筛选出来的3个具有活性的T淋巴细胞抗原表位(T lymphocyte epitope,TCE)合成tce基因(180 bp),成功插入到pMD18-T Simple载体中,筛选获得重组质粒,命名为pMD-TCE.将tce酶切产物亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒,命名为pET-TCE.用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示合成基因在pET-32a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白相对分子质量约为25 000,Western-blot分析结果表明,获得的融合蛋白可与猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性.     

新城疫病毒Roakin株HN基因的克隆及真核表达载体的构建

克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体.     

犬瘟热病毒F蛋白基因片段的克隆与表达及其表达产物抗原性的初步鉴定

本研究采用RT-PCR法扩增出犬瘟热病毒标准疫苗株的融合蛋白基因(F基因)片段约1499 bp,克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后用一对特异性的引物扩增约732 bp的F蛋白基因片段。并把该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a( )中,转化到宿主菌BL21(DE3)后进行了表达并纯化了该表达产物,Western印迹显示表达产物有良好的抗原性。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及原核表达

据GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因序列设计并合成引物,以H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,用R1PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子结果表明HA基因长为1683bp。基于HA信号肽在表达中的负作用,研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码户列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,将其亚克隆到pGEX-KG中,与GST融合表达。SDS-PAGE显示：融合表达的蛋白分子量乡为90kDa。     

微小牛蜱Bm86基因的克隆与原核表达

根据已发表的Bm86基因序列,设计表达型引物,利用RT-PCR技术,从微小牛蜱饥饿幼蜱的研磨物中扩增Bm86基因,将PCR产物连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86.测序分析表明:克隆的微小牛蜱Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97%和95.6%.然后对重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86进行双酶切,获得带有粘性末端的Bm86基因片段,并将此片段定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Bm86,将其转化到BL21宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测表明表达产物为分子量为88 Ku的融合蛋白,目的蛋白约占蛋白总量的39%,表达量约为1.08 mg/mL.Western blot分析表明此表达产物能被兔抗微小牛蜱阳性血清所识别.     

猪流产衣原体CP/12株omp-1基因的克隆与表达

为观察重组MOMP蛋白的免疫活性，揭示omp-1基因(编码MOMP蛋白)在猪流产衣原体诊断和防治中的作用，用PCR法扩增猪流产衣原体omp-1基因，将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体，测序比较分析序列后确认为目的基因，与GenBank中4株流产衣原体omp-1基因和氮基酸序列的相似性均达99％，与其他各型衣原体代表株的相似性为71％～88％，氨基酸序列也有较大差异。将omp-1基因亚克隆到pET-32a表达载体上，再对重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌，以IPTG诱导该重组菌，结果显示该重组菌表达了融合蛋白；用猪流产衣原体多克隆抗体对表达的重组MOMP蛋白进行Western blot试验，结果显示该重组MOMP蛋白具有结合特异性抗体的活性。     

牛瑟氏泰勒虫P23主要表面蛋白基因的克隆及原核表达

[目的]研究牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆及原核表达。[方法]采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫中国延边株P23基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-P23,经PCR、双酶切鉴定后测序;将目的基因片段亚克隆入表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒pGEX-4T-P23,转化宿主菌BL21获得重组菌。通过对诱导条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件;Western-blotting检测表达蛋白的反应原性。[结果]所克隆的牛瑟氏泰勒虫P23基因片段长507 bp,与牛瑟氏泰勒虫日本株P23基因的核苷酸同源性达99.4%,表达的融合蛋白大小约为46 ku;诱导时机以接种培养后2 h为最佳,诱导时间以6 h为最佳,诱导温度以34℃为最佳,0.008-1.000 mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。Western blotting检测表明该蛋白具有较好的抗原性。[结论]为牛瑟氏泰勒虫病的免疫学诊断和预防等研究奠定了基础。     

PRRSV新疆株N基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已发表的毒株,设计了一对引物扩增PRRSV新疆株N基因片段;将N基因克隆到pMD18-T,在亚克隆到pGEX-6p-1原核表达载体上,构建重组质粒pGEX-6p-N;在37℃条件下,经终浓度为1mmol／L的IPTG诱导表达4h后,获得了可溶性融合蛋白;经SDS-PAGE电泳检测和Western blotting分析,该融合蛋白分子量约为39kDa,与预期结果一致,并能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,且非特异性背景很低。     

猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表达

依据Gen Bank中猪伪狂犬病毒(PRV)BJ/YT株gD基因设计引物,扩增gD蛋白抗原表位,其设计扩增长度为702 bp,将扩增片段克隆到p MD19-T载体获得p MD19-T-gD。利用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切p MD19-T-gD质粒,进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切片段,将回收片段与原核表达载体p ET-28a连接,成功构建了p ET-28a-gD表达载体。将表达载体转化感受态细胞Rosetta,IPTG诱导表达后,进行SDS–PAGE电泳,结果显示,在25 ku处出现特异性蛋白质条带。Western blot分析结果表明,表达产物能够被PRV的阳性血清识别。综上,成功克隆并表达了gD蛋白抗原表位,且其表达产物具有较好的生物学活性。     

金黄色葡萄球菌wood46株eno基因的克隆及原核表达

为获得Eno的重组蛋白,采用PCR法从金黄色葡萄球菌wood46株基因组扩增eno基因,并连接到pMD18-T载体上,转化至BL21感受态细胞中;重组质粒经PCR及酶切鉴定后,送上海生工测序。将鉴定正确的质粒酶切回收产物与原核表达载体pET-32a连接,然后转化至BL21感受态细胞,对平板筛选的阳性质粒进行PCR和酶切鉴定。对鉴定正确的重组菌进行诱导表达并纯化。实验结果表明成功构建了pET32a-eno表达载体,并获得了该纯化蛋白。该实验结果为S.aureus亚单位疫苗研究奠定了一定的基础。     

伪狂犬病病毒gE囊膜糖蛋白主要抗原表位区基因的原核表达

参照GenBank上公布的伪狂犬病病毒gE基因序列设计1对引物,通过PCR方法扩增一段包含gE主要抗原表位编码区的564 bp的片段,扩增产物克隆于pMD18-T vector中,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游,构建的原核表达质粒pET-gE在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示:表达产物分子质量为38 ku,以包涵体的形式存在,表达产物用His亲和层析柱进行纯化。Western blotting分析表明:该蛋白能与标准阳性血清发生特异性反应。结果证明该表达产物具有生物学活性,可作为鉴别诊断的抗原。     

鸡γ干扰素在酵母中的分泌表达

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素（ChIFN-γ）eDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板．通过RT—PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenBank上发表的ChIFN-γ序列的同源性可达99．6％,其含有1个495bp的开放性阅读框架,编码164个氨基酸。通过KpnⅠ和NotⅠ两个酶切位点将该基因插入酵母表达载体（pPICZa—A）,并将该重组酵母ChIFN-γ载体线性化,通过电转化使ChIFN-γ基因整合到酵母（X-33）基因组上,经甲醇诱导后,成功表达出ChIFN-γ。利用Western—blotting分析测定表达的ChIFN-γ蛋白的活性。结果表明,本试验得到的重组酵母ChIFN-γ是具有反应原性的蛋白。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素A基因的 克隆与原核表达

从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A(poreine mannan-binding lectin A,pMBL-A)基因.再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒.将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况.结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据.     

减蛋综合征病毒五邻体重组蛋白的原核表达及抗原性鉴定

根据减蛋综合征病毒(EDSV)AV-127株的全基因序列(GenBank序列号AC000004)设计了1对引物,采用PCR扩增出五邻体(Penton)完整基因,将其连接到克隆载体pMD18-T,经过鉴定后测序。序列分析表明,所获得的DNA片段核苷酸序列和GenBank中AV-l27株的五邻体比较有9个碱基突变,但利用DNAstar分析,两者的氨基酸完全一致。然后酶切胶回收后将目的片段连接到质粒表达载体pET-30a(+),获得的阳性克隆命名为pET-30a-Penton。将pET-30a-Penton转化E.coli Rosetta,经37℃、1.0 mmol·L-1 IPTG诱导表达5 h,SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,结果显示目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为54.0 ku。Western Blot试验结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。