大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其转化研究

杂交大豆是我国具自主知识产权的科研成果，具有广阔的应用前景。为解决杂交大豆制种过程中不育系易与保持系混杂的问题，我们开展了大豆叶绿体转基因的研究，目的是通过转基因的方法在不育系的细胞质中，植入筛选标记基因，以区分不育系和保持系。根据已发表的大豆叶绿体序列（GenBank X07675）设计引物，用PCR方法获得两段大豆叶绿体同源重组序列LHRR和RHRR，克隆到质粒pUC19中，并将来源于质粒pTF102的壮观霉素抗性基因aadA克隆到两段同源重组序列之间，以构建大豆叶绿体转化表达载体pJY01。 aadA基因的启动子Prrn和终止子psbA基因3’序列，分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来。在此基础上，我们还将草丁膦抗性基因或绿色荧光蛋白与GUS的融合蛋白基因克隆到该载体上，得到pJY03与pJY04，并初步应用于烟草的叶绿体转化，获得了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗，PCR扩增出aadA基因的条带，并在激光共聚焦扫描下检测到GFP的表达，由此证实了这一实验思路的可行性，为后期大豆叶绿体转化工作的顺利进行打下了良好的基础。     

山定子遗传转化体系的优化

为了优化山定子(Malus baccata)遗传转化体系,利用DNA重组技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)克隆到植物表达载体pBI121中,得到新型的重组质粒pBI121-eGFP。重组pBI121-eGFP质粒在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介导下转化山定子。结果表明,叶片切块后振荡侵染5~8min,共培养3 d,之后用含有500 mg/L Cef的MS液体清洗后转移到含有300 mg/L Cef的筛选培养基中,同时卡那霉素的筛选浓度由5 mg/L加大到20 mg/L时,获得的转化效率较高。对体系优化过程中获得的7株抗性苗进行了PCR检测、RT-PCR分析、绿色荧光现象观察及荧光蛋白信号分析,结果显示,其中6株抗性苗PCR检测呈阳性,3个eGFP基因表达量较高的转基因株系T1、T3和T6的绿色荧光现象较强,且具有较高的荧光蛋白信号。荧光检测与分子检测结果基本一致,从而可以利用绿色荧光直接检测转基因植株,达到优化山定子遗传转化体系的目的。     

Bt毒蛋白基因叶绿体转化载体的构建及其生物杀虫试验

本工作设计和构建了全长３．５ｋｂ Ｂｔ毒蛋白基因和２．１ｋｂ、１．８ｋｂ两种３＇端缺失Ｂｔ毒蛋白基因并分别包含烟草叶绿体同源片段ＲＴＰ和ＴＯ的叶绿体转化载体ｐＴＲＳ１、ｐＴＲＳ２和ｐＴＲＳ３，对它们菌体总蛋白进行生物杀虫试验表明所有载体的Ｂｔ毒蛋基因都得到了表达，并且对二龄棉铃虫有１００％的毒杀作用，对三龄棉铃虫的致死率也很高，尤其是含全长Ｂｔ毒蛋白基因的ｐＴＲＳ１可高达９５％以上。因而它们都可以     

叶绿体转化及其应用于作物改良研究的最新进展

农杆菌介导的核基因转化技术已普遍应用于作物改良和分子育种方面,而其不可避免的转基因沉默现象和生物安全问题是科研工作者和广大民众关注的焦点,进而成为基因工程技术广泛应用的主要限制因素。叶绿体遗传转化技术因具有核转化不可比拟的独特优势,成为植物基因工程发展的新方向和科研工作者研究的热点之一,通过该技术有望培育出真正生物安全的转基因作物新品种。本文围绕叶绿体转化的原理、方法、筛选标记及其应用等方面进行阐述,着重介绍其在作物改良方面研究的最新进展,并对存在问题及应用前景进行了展望。     

叶绿体转化及其用于疫苗表达研究的最新进展

随着植物转基因研究的不断深入,核基因组转化的转基因沉默现象严重影响了基因工程的应用效果.植物叶绿体遗传转化以叶绿体基因组为平台对植物进行遗传操作,外源基因定点整合及母性遗传特性能较好地解决＂顺式失活＂和＂位置效应＂等类的基因沉默问题和转基因逃逸等安全问题,成为植物基因工程发展的新方向,在工业、农业及医药生物领域发挥了重要作用,也为生产廉价、安全的植物疫苗提供了新思路.本文在简要介绍叶绿体转化的原理、转化方法与优势的基础上,重点综述了近年来通过该技术表达的一些重要的病毒抗原和细菌抗原.最后,对叶绿体转化技术在表达外源基因方面存在的问题进行分析.未来随着叶绿体基因表达、调控机制研究的逐渐深入及相关技术体系的日臻完善,叶绿体转化有望成为疫苗生产的生力军.     

大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其在烟草上的转化研究

为解决杂交大豆(Glycinemax)制种过程中不育系易与保持系混杂的问题,开展了大豆叶绿体转基因的研究。通过转基因方法在不育系的细胞质中植入筛选标记基因,以区分不育系和保持系。根据已发表的大豆叶绿体序列(GenBankX07675)设计引物,用PCR方法获得两段大豆叶绿体同源重组序列LHRR和RHRR,克隆到质粒pUC19中,并将来源于质粒pTF102的壮观霉素抗性基因aadA克隆到两段同源重组序列之间,以构建大豆叶绿体转化表达载体pJY01。aadA基因的启动子Prrn和终止子psbA基因3′序列,分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来。在此基础上,将草丁膦抗性基因或绿色荧光蛋白与GUS的融合蛋白基因克隆到该载体上,得到pJY03与pJY04,并初步应用于烟草(Nicotianatobacum)的叶绿体转化,获得了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗,PCR扩增出aadA基因的条带,并在激光共聚焦扫描下检测到GFP的表达。     

山羊乳腺上皮细胞的培养及EGFP基因转化

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物，并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现：纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构，呈乳头状，称之为乳球体；乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型，大多数上皮细胞呈短梭形或多角形，呈蜂窝状；部分细胞呈圆饼状，体积较大；部分细胞呈长形。采用电穿孔法将绿色荧光蛋白（EGFP）基因转化体外培养的山羊乳腺上皮细胞，荧光显微镜下观察到EGFP基因的表达。     

PHAs合酶phaC2基因转化烟草叶绿体的研究

中长链羟基脂肪酸聚酯 (medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。Ⅱ型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶。将编码Ⅱ型PHA合酶的基因phaC2与水稻(Oryza sativa )叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建表达盒(RpsbA-pro-phaC2-RpsbA-ter)，连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒(prrn-aadA-TpsbA-ter)一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD中，构建了烟草叶绿体转化表达载体pTC2。基因枪法转化烟草(Nicotiana tobacum L.)叶片，获得具有壮观霉素抗性的转基因烟草。对T0代和T1代转基因植株的PCR和Southern blot鉴定结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中，T1代转基因植株已达同质化。RT-PCR分析结果证实phaC2基因已在转录水平上表达。转基因植株的正反交试验证明外源基因在转基因后代中遵循母性遗传规律，不存在转基因的花粉漂移现象。通过叶绿体遗传转化, 实现中长链羟基脂肪酸聚酯合成关键酶基因phaC2在烟草叶绿体基因组中的稳定转化。     

pBI121-LyrZ-GFP表达载体的构建及其在和田苜蓿愈伤组织中的转化

将绿色荧光蛋白（GFP）基因片段插入到pBI121-Lyz多克隆区,构建了重组表达载体pBIl21-Lyz-GFP。经SmaⅠ与BamHⅠ双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明,GFP基因已成功地连接到pBI121-Lyz中,且重组质粒连接方向正确。利用冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumenfaciens ） LBA4404,,用叶盘法转化和田苜蓿（Medicago sativa L. cv. Xinjiang Daye）,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明,重组基因已成功地转化到和田苜蓿愈伤组织中。     

pBI121-Lyz-GFP表达载体的构建及其在和田苜蓿愈伤组织中的转化

将绿色荧光蛋白(GFP)基因片段插入到pBIl21-Lyz多克隆区,构建了重组表达载体pBI121-Lyz-GFPo经Sma Ⅰ与BamH Ⅰ双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750 bp的目的片段,通过进一步测序证明,GFP基因已成功地连接到pBI121-Lyz中,且重组质粒连接方向正确.利用冻融法将重组质粒导人根癌农杆菌(Agrobactcrium tumenfaciens)LBA4404,用叶盘法转化和田苜蓿(Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye),筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明,重组基因已成功地转化到和田苜蓿愈伤组织中.     

GFP叶绿体转化烟草茎叶降解对土壤微生物数量及土壤酶活性的影响

以GFP叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）为材料,在实验室条件下研究了叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）在茎叶降解过程中及完全降解后对土壤微生物主要类群（细菌、真菌、放线菌）的影响,并对相关的土壤酶活性进行了分析。结果表明,在烟草茎叶降解过程中及完全降解后：（1）叶绿体转基因烟草及对照烟草（非转基因烟草）对微生物的数量影响不显著;（2）土壤微生物总量相比为细菌〉放线菌〉真菌;（3）叶绿体转基因烟草茎叶降解对土壤酶活性没有显著影响;（4）GFP基因没有水平转移到土壤微生物基因组中。以上结果显示GFP叶绿体转化烟草茎叶降解对土壤微生物数量及土壤酶活性没有显著的影响。     

大白菜高效遗传转化体系的建立

研究了影响根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌系介导的大白菜（Brassica campestris L.ssp.pekinensis)遗传转化转化的若干因素,建立了大白菜快速有效的遗传转化体系,获得了转基因抗性苗。结果表明,大白菜的不同基因型,苗龄,外植体类型,以及预培养与否,工程菌液浓度,侵染时间,共培养基的pH值和Co^2 ,卡那霉素,头孢霉素浓度等对转化频率都有一定的影响。最高转化频率可达5．74％。而不同共培养方式和附加乙酰丁时酮对转化效果影响不明显。抗性植株经PCR和Souhern blot检测表明,目的基因已整合进大白菜基因组中。     

速生型刺槐遗传转化体系的建立

为获得稳定的转基因刺槐植株,以速生型刺槐叶轴为转化受体,对转化过程中的一些影响因素进行了探究,建立了较为完善的遗传转化体系。结果表明:继代20~35d之间刺槐叶轴最适宜转化;卡那霉素的筛选浓度为30mg/L;头孢霉素的抑菌浓度为200mg/L;合适的侵染时间是20min;30mg/L的乙酰丁香酮有利于抗性芽的发生;共培养2d对转化适宜;抑菌7d后再加选择压有利于抗性芽的产生。最后得到的抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因OsDREB1已整合到刺槐基因组中。     

有机肥和化肥对烟叶气体交换、叶绿素荧光特性及叶绿体超微结构的影响

【目的】本文以烤烟K326为材料,探讨了在不同叶龄时期有机肥与化肥在烟叶气体交换参数、叶绿素荧光特性、叶绿素含量及叶绿体超微结构等方面的差异,以期从光能利用(宏观)及叶绿体超微结构(微观)方面,揭示两种肥料配比对烟叶光合作用的影响机制,同时为探索烟叶高产优质栽培模式提供理论依据。【方法】以蛭石为栽培基质进行盆栽试验。设施用烤烟专用有机肥(N∶P2O5∶K2O为9∶9∶10,有机质≥70%,中、微量元素≥12%)和施用普通尿素两个处理。烟草为工厂化无毒育秧苗,叶龄(叶龄从叶片长约2 cm时算起)15天、30天、45天、60天和75天取样或测定自上而下第6~8片叶。用Li-6400(美国)便携式光合仪测定烟叶的净光合速率,蒸腾作用与气孔导度。使用M系列调制叶绿素荧光成像系统Maxi-Imaging-PAM(德国)测定叶绿素荧光参数。用C-7000透射电子显微镜观测叶绿体超微结构并拍照,用软件Auto CAD 2004计算淀粉颗粒在叶绿体中所占的相对面积比Ra,叶绿体基粒片层的统计方法据Goodenough等改进的Teichler-Zallen法。【结果】有机肥对烟叶叶绿素含量及光合速率的影响显著,在叶龄60天时,其叶绿素含量比普通化肥高136.1%;在叶龄75天时,其烟叶净光合速率、气孔导度及蒸腾速率分别比普通化肥处理高135.3%、84.5%和51.3%,叶绿素荧光参数Y[Ⅱ]和q L分别比普通化肥处理高22.2%和39.5%,Fv/Fm在叶龄60天时比普通化肥处理高18.7%,而NPQ值在叶龄45天时普通化肥比有机肥处理高23.3%。叶绿体内孕育的淀粉粒随叶龄的增加而逐渐膨大,期间伴随着淀粉粒在叶绿体中所占的面积比例(Ra值)越来越大,两处理Ra值差异明显,尤其是在叶龄45天时,化肥栽培下的烟叶Ra值比有机肥栽培高31.8%。有机肥处理的叶绿体呈梭形,长宽比大,而普通化肥种植的叶绿体形态近圆形,长宽比小。【结论】施用有机肥可显著提高烟叶叶绿素含量及光合速率,且随叶龄的增加,有机肥的作用效果日趋明显。叶绿素荧光参数的差异表明,增施生物有机肥可延缓烟株衰老、提高烟叶光能利用效率。两种施肥方式下,淀粉颗粒Ra值的差异不能说明施用化肥可提高烟叶合成淀粉的能力。与普通化肥处理下的烟叶相比,有机肥可显著提高叶绿体基粒垛叠数大于10的片层占基粒垛叠片层总数的百分比。     

钙过量对茶树光合特性及叶绿体超微结构的影响

茶树是一种嫌钙植物,本文通过砂培试验,研究了不同钙过量水平对茶树光合作用、叶绿素荧光参数、叶片色素含量、叶绿体超微结构及茶树新梢生长的影响,旨在探明钙过量对茶树光合生理的影响,同时为解释高钙茶园中茶树生长不良提供一定的理论依据。结果表明: 不同钙过量处理,随着钙浓度的升高,茶树净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs） 逐渐降低; 茶树叶片Chl a/Chl b升高,总Chl含量逐渐降低; 茶树叶片原初光能转换效率（Fv/Fm）、光合电子传递速率（ETR）、光合电子传递量子效率（ΦPSⅡ）逐渐降低,初始荧光（Fo）则升高; 叶绿体片层结构遭到破坏; 同时钙过量处理的茶树新梢生长受到抑制,其节间距、新梢长度、展叶数、叶面积均明显低于对照。上述结果说明: 钙过量处理在一定程度上可引起光合系统膜结构的破坏,导致电子传递链受阻,茶树叶片光能利用效率降低,从而影响茶树新梢的生长。     

草莓主栽品种Tudla遗传转化体系的建立

本研究建立起农杆菌介导的草莓主栽品种Ｔｕｄｌａ的转化体系,获得了转化植株,试管苗叶片与携双元载体ｐＭＯＧ４１０的农杆菌菌株ＥＨＡ１０５共培养３天,共培养后叶片在附加止那霉素４０ｍｇ．Ｌ＾－１的再生培养基（ＭＳ＋ＴＤＺ２．０ｍｇ．Ｌ＾－１＋ＩＢＡ０．１ｍｇ．Ｌ＾－１）上选择培养４周后,外植株再生出明显可见的转化芽,转化芽再生频率达４．５％,转化芽在附加卡那霉素２５ｍｇ．Ｌ＾－１草莓继代培养基上分化成     

利用植物叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗研究进展

植物是医用药物的重要来源之一,约占整个医用药物市场的1/4以上。现代生物技术的发展进一步拓宽了植物在医药领域的应用范围,许多具有重要应用价值的重组药用蛋白在植物中获得成功表达,部分重组药用蛋白已进入商业化应用阶段。与其他重组药用蛋白生产系统相比,植物叶绿体生产系统具有独特的优势,如外源基因的高效和稳定表达、多基因表达、环境安全等。利用植物叶绿体表达系统生产的重组药用蛋白和疫苗已达40多种。本研究对近年来利用叶绿体表达重组药用蛋白和疫苗的研究进展进行了综述,并就植物叶绿体表达重组药用蛋白方面的几个问题进行了探讨。     

镁对槟榔幼苗光合特性和叶绿体超微结构的影响

【目的】研究不同供镁水平对槟榔幼苗叶片叶绿体超微结构及光合特性的影响,为槟榔的平衡施肥矫治技术和高产优质栽培提供理论依据。【方法】以三叶龄‘热研1号’槟榔幼苗为试材进行了沙培试验。采用1/2 MS完全营养液,即对照处理Mg浓度为0.75 mmol/L,缺Mg (–Mg) 和高Mg (+Mg) 处理分别为不添加Mg和添加Mg 2.25 mmol/L。幼苗生长5个月后,取样测定槟榔幼苗非结构性碳水化合物含量、蔗糖合成酶 (SS) 和蔗糖磷酸合成酶 (SPS) 活性、叶绿素荧光动力学参数,观测叶绿体超微结构。【结果】1) 缺镁处理导致槟榔叶绿素相对含量 (SPAD)、光系统Ⅱ (PSⅡ) 的最大光化学效率F_v/F_m、实际光化学效率Y(Ⅱ)和光化学淬灭系数qP显著降低,而高镁处理组与对照差异不显著;2) 缺镁处理槟榔叶片的可溶性糖、蔗糖含量较对照均显著升高,而淀粉含量显著降低;高镁处理组淀粉含量显著高于对照组,但可溶性糖和蔗糖含量差异不显著;3) 缺镁胁迫致使叶绿体膜解体,基粒片层大部分消失,类囊体片层结构断裂,噬锇颗粒数目增多;高镁处理时叶绿体发生变形,叶绿体膜模糊,基粒片层部分消失,噬锇颗粒和淀粉粒增多。【结论】缺镁胁迫下,槟榔幼苗叶绿体超微结构发生变异,叶绿素合成及碳代谢受阻,光合效率降低,而高镁处理对槟榔叶片的影响显著小于缺镁处理。