中药体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒的影响

采用细胞培养的方法测定了细胞安全浓度范围内的自拟药方（抗病毒合剂）抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞的作用。结果表明,抗病毒合剂有较强的抗病毒作用,并呈一定的量效关系。先加药物后加病毒时,46.88～6000μg/ml范围内作用显著、93.75μg/ml的作用最好;先加病毒后加药物时,375～6000μg/ml范围内作用显著、6000μg/ml的作用最好。这可能是抗病毒合剂治疗猪繁殖与呼吸综合征等病毒病的机理之一。     

抗猪繁殖与呼吸障碍综合征中药单体成分的体外筛选

为体外筛选具有抗猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）的中药单体,本研究选择4味有效的中药单体成分,以Marc-145细胞为靶细胞,从阻断吸附、抑制复制和直接杀灭3个层面进行抗PRRSV研究,以CPE、病毒滴度评价药物抗PRRSV的效果。结果显示,绿原酸和连翘苷可明显抑制PRRSV在细胞内的复制|适当浓度的奎宁酸、绿原酸和连翘苷对PRRSV有较好的直接杀灭效果。综合阻断吸附、抑制复制和直接杀灭效果,绿原酸和连翘苷是理想的抗PRRSV中药单体药物。本研究为猪繁殖与呼吸障碍综合征防控提供了试验依据。[关键词]猪繁殖与呼吸综合征|中药单体|抗病毒|病毒复制     

RNAi抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是世界上主要的猪传染性疾病之一,以妊娠母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔猪高死亡率和育成猪呼吸困难,类流感症状、发育迟缓为主要的特征。该病给各个国家的养猪业带来巨大的经济损失,目前,疫苗和抗病毒药物只能提供有限的保护。自2006年以来,不断有研究者应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术开展抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究,并取得了一些阶段性成果。对已有的研究成果进行了综述。     

中药抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用机制研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的烈性、高度接触性传染病,主要引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。疫苗免疫是防控PRRS的主要手段,但由于PRRSV毒株高度变异性导致疫苗对该病的效果仍不理想。中药(traditional Chinese medicine, TCM)活性成分众多,生理活性多样,包括抗菌、抗病毒和抗氧化等作用,是抗病毒药物的研究热点。研究证明,中药能以单体或复方的方式对PRRSV产生抑制增殖、阻断吸附和杀灭病毒的作用,以及对机体免疫反应产生影响。关于中药抗PRRSV的机制包括直接抗病毒机制和间接抗病毒机制。直接抗病毒机制即中药有效成分对病毒复制周期的直接影响,主要表现为抑制病毒的吸附、内化、复制、大分子组装和释放中的一环,从而达到抑制病毒的作用。间接抗病毒机制即中药有效成分通过调节细胞因子合成、炎症信号通路、细胞凋亡、氧化代谢和免疫系统...     

抗猪繁殖与呼吸综合征病毒中药多糖复方的体外筛选

为了筛选出抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)效果较好的多糖复方,以前期筛选出的枸杞多糖、当归多糖、板蓝根多糖、淫羊藿多糖、黄芪多糖、黄精多糖组成8个多糖复方,以OD570值和病毒的抑制率为评价指标,采用MTT法测定3种不同的作用方式下各多糖复方抗PRRSV感染细胞能力。结果表明,多糖复方的3种作用方式,以对病毒的直接杀灭作用效果最好,其中复方②(淫羊藿-黄精-当归-黄芪)和复方③(淫羊藿-黄精-板蓝根-黄芪)3种加药方式的抗病毒效果均较好,可作为抗PRRS的候选方剂。     

纳米银体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用研究

【目的】 研究纳米银（silver nanoparticles,AgNPs）体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】 使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数（multiplicity of infection,MOI） PRRSV （0.0001~0.1）黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】 AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5 μg/mL,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间（3、6、12、18、24 h）加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】 AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。     

龙胆草及其提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

为研究龙胆草水提取物、龙胆草总黄酮、龙胆草总苷体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的作用,本试验建立Marc-145细胞模型,在研究其对Marc-145细胞最大安全浓度的基础上,结合细胞病变形态观察和MTT法,设立药物组、利巴韦林阳性对照组、病毒对照组和细胞对照组,对病毒进行阻断、抑制和直接灭活3种作用方式的测定。结果显示,龙胆草水提取物、龙胆草总黄酮、龙胆草总苷和利巴韦林的最大安全浓度分别为6.250、0.020、0.630和0.016 mg/mL。在体外抗PRRSV作用的试验中,龙胆草水提取物对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为43.1%、57.4%和56.4%,均低于阳性对照利巴韦林,且各作用方式下细胞均发生了明显病变。龙胆草总黄酮对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为66.1%、41.1%和42.7%,其抑制作用和直接灭活作用的抑制率均低于阳性对照利巴韦林,阻断作用下细胞轻微病变。龙胆草总苷对病毒的阻断、抑制和直接灭活作用的最高抑制率分别为33.4%、78.2%和81.9%,其抑制和直接灭活作用较强,远高于阳性对照利巴韦林,且在这两种作用方式下细胞基本保持单层完好。综合3种作用方式,3种龙胆草提取物中龙胆草总苷抗PRRSV的效果最好,其次是龙胆草水提取物和龙胆草总黄酮。     

3种中药及其提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

为研究板蓝根、黄芪和青蒿及其提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的作用,本试验在研究板蓝根、黄芪和青蒿及其提取物对Marc-145细胞最大安全浓度的基础上,研究3种中药提取物体外抗PRRSV的作用。结果显示,板蓝根多糖、黄芪多糖和青蒿素3种中药提取物对Marc-145细胞安全浓度分别为为0.03、0.03和0.06 mg/mL,板蓝根、黄芪和青蒿3种中药单方的安全浓度分别为6.25、6.25和3.13 mg/mL。在体外抗PRRSV作用的试验中,3种中药单方中黄芪的阻断作用最强,能达到100%的保护率,中药提取物中板蓝根多糖对PRRSV的阻断作用最强,在浓度为0.031 mg/mL时对细胞保护率能达到48.03%,青蒿素最差,在0.16 mg/mL时就已不具有阻断作用。板蓝根多糖对病毒不具有直接杀灭作用,黄芪多糖和青蒿素在浓度为0.32 mg/mL时,保护率都是20%左右;黄芪的直接杀灭作用保护率为100%,且非常稳定,青蒿在浓度较高时还有促进细胞生长的作用,但稳定性差,随浓度降低其保护率迅速下降。在对病毒的抑制作用试验中,3种中药提取物的作用相当,浓度为0.01 mg/mL时,板蓝根多糖、黄芪多糖和青蒿素多糖对细胞的保护率分别为24.57%、24.30%和26.20%;而3种中药单方的细胞保护率都能达到100%甚至以上。综合3种作用方式可知,3种中药提取物中,黄芪多糖的抗PRRSV作用最好,青蒿素次之,板蓝根多糖最差;3种中药单方中黄芪的效果最好,青蒿最差。因此,可知黄芪及其提取物具有非常强的抗PRRSV作用,可对其进行进一步研究,以供临床上使用。     

金银花提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒研究

通过观察金银花提取物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的Marc-145细胞的保护效果、对病毒感染滴度(TCID50)的影响及对ORF7mRNA表达的影响来评价其体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性。结果表明,金银花提取物大孔树脂600mL/L的乙醇/水洗脱部位对PRRSV感染细胞具有较好的保护效果,最小保护浓度为6.25μg/mL。6.25μg/mL 600mL/L的乙醇/水洗脱部位使PRRSV病毒滴度从105.8 TCID50降低至100.3 TCID50左右,使PRRSV ORF7mRNA含量降低1 000多倍。因此,金银花提取物大孔树脂600mL/L的乙醇/水洗脱部位具有良好的体外抗PRRSV活性。     

双香豆素对猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外抑制作用

为探究双香豆素(DIC)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的影响,本研究首先通过CCK-8法检测DIC对Marc-145细胞的细胞毒性,并计算其半数毒性浓度(CC₅₀);进而使用荧光定量PCR和Western blot检测DIC对PRRSV增殖水平的影响;通过不同给药方式处理细胞进一步探究DIC针对的PRRSV增殖阶段。结果表明,DIC对Marc-145细胞的细胞毒性CC₅₀为96.11μmol·L^-1,并在浓度为25μmol·L^-1时即表现出明显的抗PRRSV活性;DIC可以呈剂量依赖性地抑制不同时间和不同滴度的PRRSV增殖。DIC对PRRSV感染周期的吸附、入胞和释放阶段无影响,但是可明显抑制PRRSV的复制阶段。本研究证实DIC以较低浓度在Marc-145细胞中表现出明显的抗PRRSV活性,并主要针对PRRSV的复制阶段。本研究提示双香豆素具备开发成临床抗病毒药物或添加剂的潜力,为新的PRRSV抗病毒药物的研发提供理论依据。     

三种中药提取物体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的作用

在前期筛选具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)作用的中药研究基础上,选取药效较好的三种中药：穿心莲、芦根和夏枯草。为进一步研究其有效抗病毒成分,采用MTT 法观察了穿心莲内酯盐、芦根多糖和夏枯草多糖成分对猴肾上皮细胞系(Marc-145) 生长的影响,分别采用阻断、抑制、直接杀灭3种作用方式观察了各成分抗RPPSV感染作用。结果显示：穿心莲内酯盐对细胞最大安全浓度为0.16 mg/mL,芦根多糖为0.575 mg/mL,夏枯草多糖为1.125 mg/mL;芦根多糖在三种方式上均有不同程度的抗PRRSV作用,而穿心莲内酯盐和夏枯草多糖阻断PRRSV作用不明显,抑制和杀灭PRRSV作用明显。结果表明穿心莲内酯盐、芦根多糖和夏枯草多糖均有抗病毒作用,为抗病毒中药的主要药效成分。     

猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9 mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28 ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×10³ IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×10³ IU/mL。     

Antiviral Effects of Three Chinese Herbal Medicine and Their Polysaccharides on Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) in vitro

In order to figure out the antiviral effects of Radix Isatidis,Astragalus herb,Artemisia annua and their polysaccharides on porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in vitro,the antiviral activity of the three Chinese herbal medicine and their polysaccharides,Isatis root polysaccharide (IRPS),Astragalus polysaccharides (APS) and artemisinin maximum were evaluated by adding to Marc-145 cell cultured with PRRSV respectively.The results showed that the safety concentrations of IRPS,APS and artemisinin to Marc-145 cells were 0.03,0.03 and 0.06 mg/mL;The safety concentrations of Radix Isatidis,Astragalus herb,Artemisia annua to Marc-145 cells were 6.25,6.25 and 3.13 mg/mL.Almost all the cells (about 100%) were protected from PRRSV when Astragalus herb were added early to PRRSV,while IRPS had the same effect on PRRSV among three extracts with 48.03% cells were protect and artemisinin could not protect cells when the concentration was lower than 0.16 mg/mL.IRPS had no effect on PRRSV while APS and artemisinin got a protection rate for cells at about 20% when simultaneously added with PRRSV,under the concentration of 0.32 mg/mL.In terms of simultaneously added with PRRSV,Chinese herb Astragalus could exterminate the virus directly with its protect cells coming to 100% and more.Artemisia annua could promote the growth of cells but its stability was weak.Its protection rate decreased as its concentration reducing.In the experiment of exploring the antivirus effect of infected cells,polysaccharides of these three herbs had nearly the same effect.When in a concentration of 0.01 mg/mL,IRPS,APS and artemisinin respectively protected 24.57%,24.30% and 26.20% cells.However,the protection rate to cells of the three herbs themselves was respectively up to 100% or more.In conclusion,in the extracts of the three herbs,APS had the best antiviral effect,followed by artemisinin and IRPS,and in the single herbal medicines,Astragalus was the best and Artemisia annua was worst.Therefore,Astragalus and APS had the best antiviral effect on PRRSV.It needed more research on Astragalus and APS,and try to use them as antiviral drug in clinical application.     

脂多糖对猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导的抗病毒免疫反应的影响

为研究脂多糖对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)诱导的抗病毒免疫反应的影响,本研究采用100 TCID₅₀的PRRSV感染猪肺巨噬细胞（porcine alveolar macrophage,PAM）,感染12 h后用100 ng/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理感染细胞,分别培养12、24、36、48 h后收集细胞及上清,同时设PRRSV组、LPS组和PAM细胞组,用河南农业大学兽医微生物研究室已建立的Real-time qPCR方法对LPS+PRRSV组和PRRSV组中PRRSV复制水平及各组PAM细胞中IFN-α、TNF-α mRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示,LPS+PRRSV组与PRRSV组相比,PRRSV拷贝数12～48 h均较低,IFN-α mRNA转录水平显著升高（P＜0.05）,TNF-α mRNA转录水平升高,在48 h时转录水平降低。而与LPS组相比,LPS+PRRSV组IFN-α mRNA转录水平在12 h时升高,24、36、48 h均降低。结果表明,PRRSV感染PAM细胞经LPS刺激后,IFN-α、TNF-α mRNA转录水平显著升高（P＜0.05）,从而抑制了PRRSV在PAM细胞内的复制。     

猪生殖——呼吸综合征病毒研究进展

对猪生殖与呼吸综合征病毒新的分类地位,基因结构特点,病毒蛋白的功能、病毒在细胞的增殖过程,增殖特点、毒株变异等新进展及病毒独特的生物学行性作了综述,提出了病毒变异和毒力差异的分子基础是需要进一步研究的问题。     

猪繁殖与呼吸综合征致病机理的研究进展

PRRS(猪繁殖与呼吸综合征)复杂的发病机制包括抗体依赖性增强、引起机体免疫抑制和在机体内持续性感染等现象,以及病毒遗传多样性;这些是该病难以防控的主要原因,本文就近年有关进展进行综述。     

上海地区猪场中家鼠PRRSV和CSFV带毒情况调查

从上海9家猪场内采集的46只家鼠的血清和组织样品,采用IHA、ELISA和RT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的抗体及抗原进行了检测,结果均为阴性。由此说明家鼠对这两种病毒不易感,不可能作为PRRSV和CSFV的传播媒介和贮存宿主。     

猪繁殖—呼吸综合征病毒的形态学

利用电子显微技术，对从上海某发病猪场分离到3株猪繁殖－呼吸综合征病毒（PRRSV）和标准美洲株（ATCC－VR2332）进行了形态特征的比较。结果表明，这4株病毒形态特征无显著差异。负染显示该病毒以球形为主，具有囊膜，囊膜上有纤突，大小为60－85nm。超薄切片可见病毒粒子大量存在于细胞浆内，有囊膜的直径为60－80nm，没有囊膜的直径为40－50nm，在细胞的线粒体，高尔基体和双基核膜内可见病毒粒子。在病毒增殖的同时，Marc-145细胞的显微结构逐渐发生破损，显示病毒的释放是通过破坏细胞膜结构的完整性来实现的。