AFLP分子标记技术在昆虫学研究中的应用及展望

扩增片段长度多态性技术（AFLP）已经成为一个普遍应用的分子标记技术,具有集成高效性、高信息量、无需知道序列信息等诸多优点,近年来又在酶切、扩增体系、检测和分析方法等方面不断得到改进,已广泛应用于生物学的各个领域。近十年来,AFLP分子标记技术在昆虫学研究中得到广泛应用,极大地促进了人们对昆虫多样性遗传基础的了解。目前研究人员已经利用该技术绘制了有益昆虫以及农艺学上重要害虫的基因连锁图谱,并对控制相关性状的基因进行了标记以及QTL定位等。本文简要介绍了AFLP分子标记技术在有益昆虫、重要农业害虫、检疫害虫等研究中的应用,并对该技术应用前景进行了简单的展望。     

井冈霉素A对水稻抗性相关酶活性的影响

测定了用井冈霉素A处理后3、7、14和21天后盆栽水稻植株的海藻糖酶、内切几丁酶和内切几丁酶和内切β-1，3-葡聚糖酶的活性。结果表明，药剂处理后14天内水稻植株体内的海藻糖酶活性明显比对照(清水处理)下降；内切几丁酶的活性一直比对照明显增高；内切β-1，3-葡聚糖酶的活性在药剂处理后第3天最高，之后逐渐下降。海藻糖酶活性下降、内切几丁酶和β-1，3-葡聚糖酶活性动态增高的结果与盆栽水稻叶面药剂处理控制纹枯病的效果和持续时间相吻合。这为揭示井冈霉素的作用机理和深入理解农用抗生素的作用方式提供了新的线索。     

植物病原菌黄单胞菌的分类研究进展

黄单胞菌是一类重要的植物病原细菌。由于其经济重要性,对该属细菌进行了大量的研究,方法包括DNA杂交、基于代表性序列的多聚酶链式反应技术和扩增片段长度多态性(AFLP)基因组指纹图谱技术等。本文主要介绍了黄单胞菌属的分类研究进展。     

拟悬铃木根结线虫及其相似种的rDNA-ITS-RFLP分析

本文用特异性引物F195和V5367,对拟悬铃木根结线虫和花生根结线虫的核糖体DNA内转录间隔区（rDNA-ITS）进行了PCR扩增,扩增产物用5种限制性内切酶Taq Ⅰ、Rsa Ⅰ、Msp Ⅰ、Cla Ⅰ、HaeⅢ进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析.Taq Ⅰ、Rsa Ⅰ、Msp Ⅰ、Cla Ⅰ酶切拟悬铃木根结线虫的rDNA-ITS扩增产物所获得限制性酶谱与花生根结线虫的限制性酶谱一致,只有HaeⅢ酶切拟悬铃木根结线虫和花生根结线虫的rDNA-ITS产物所得酶谱不同.rDNA-ITS扩增产物的HaeⅢ酶切图谱可以区分拟悬铃木根结线虫和花生根结线虫.     

可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1信号肽的鉴定及其酶活性分析

为明确可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1是否能够分泌至胞外及其活性,采用酵母互补试验分析了内切酶LtEg1的信号肽活性,利用3,5-二硝基水杨酸法检测了内切酶LtEg1活性,通过实时荧光定量PCR测定了LtEg1基因在不同侵染阶段的表达量。内切酶LtEg1的信号肽和酵母蔗糖酶的融合表达能够引起酵母蔗糖酶的外泌,使得酵母转化子能够在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长。内切酶LtEg1能够以羧甲基纤维素钠为底物,发挥其酶活功能。与营养菌丝阶段相比,LtEg1基因在病原菌侵染阶段的表达水平显著升高;且在接种后48 h,LtEg1基因的表达量达到高峰,约为营养菌丝阶段的12倍,表明内切酶LtEg1作为重要的外泌蛋白酶,在可可毛色二孢侵染致病过程发挥了重要作用。     

小麦禾谷胞囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因(rDNA)限制性片段长度多态性研究

 采用PCR技术扩增出中国和摩洛哥禾谷胞囊线虫群体的核糖体基因(rDNA)的内转录间隔区(ITS)片段的长度约为1 060 bp。用11种限制性内切酶(RE)酶切禾谷胞囊线虫ITS扩增产物,共产生27个酶切片段。用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国禾谷胞囊线虫ITS属于"B型",而摩洛哥禾谷胞囊线虫ITS属于"A型"。用HinfI酶切后,7个中国禾谷胞囊线虫群体产生2个RFLP片段(860和200 bp),而摩洛哥群体产生3个RFLP片段(520、340和200 bp),HinfI揭示出中国与摩洛哥禾谷胞囊线虫ITS之间存在差异。AvaI和HindⅢ不能酶切禾谷胞囊线虫ITS。用CfoI、Bsh1236I、MsrFI、ScrFI、HaeⅢ和MvaI 6种RE酶切中国和摩洛哥禾谷胞囊线虫群体的rDNA-ITS,均分别得到相同类型的RFLP分布型,因此这6种RE不能揭示中国与摩洛哥群体的rDNA-ITS的差异。     

青海、陕西部分地区禾谷孢囊线虫 rDNA-ITS-RFLP的特征分析

 采自我国青海、陕西等省地11个寄生小麦的孢囊线虫群体经形态学鉴定为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)。用PCR技术扩增获得的rDNA-ITS片段长度约为1 060 bp。用Hinf Ⅰ、Taq Ⅰ、Hpa Ⅱ、Hae Ⅲ、Pst Ⅰ、Alu Ⅰ 等6种限制性内切酶酶切ITS扩增产物;青海10群体YBT10A、HY65A、HY61B、ZHZ162B、HY5B、HHX8A、GH132A、HY92A、HY127B、DT142A 的6个酶的RFLP图谱完全一致;陕西YL4A群体的Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ和Hpa Ⅱ酶切结果与青海群体的上述3种酶切结果相同,但Alu Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切结果比青海孢囊线虫群体都多1条1 060 bp片段,而YL4A群体Taq Ⅰ酶切结果较为复杂。对比已知Avenae组成员RFLP图谱,青海群体与北京房山H.avenae群体的RFLP图谱一致;而陕西YL4A的Alu Ⅰ图谱与H.avenae法国群体一致,Pst Ⅰ和Taq Ⅰ却与Avenae组成员已知酶切结果均不一致。河南3个禾谷孢囊线虫群体除Taq Ⅰ酶切结果比青海CCN群体多1条520 bp片段以外,其他5种酶的RFLP都一致,而与澳大利亚的禾谷孢囊线虫H.avenae群体的RFLP图谱一致。     

番茄叶霉病高抗基因Cf-9的CAPS标记创建

根据番茄叶霉病高抗基因Cf-9的基因序列设计3对特异扩增引物,以近等基因系和本组的多重PCR检测材料为试材,扩增Cf-9基因1～2867 bp之间的单拷贝片段,3对引物分别扩增出560 bp,1 000 bp,1 080 bp的特异片段。分别用限制性内切酶TaqⅠ,HindⅢ,HinfⅠ,EcorⅠ酶切,限制性内切酶TaqⅠ酶切特异引物SCAR1扩增的560特异片段具有酶切多态性,抗病品种酶切出450 bp,330 bp,290 bp的特异片段,感病品种酶切出450 bp,290 bp的特异片段。初步建成番茄叶霉病高抗基因Cf-9的CAPS标记,经近等基因系及其杂交种检验,结果稳定可靠,可用于番茄Cf-9抗病基因辅助选育。     

黄瓜花叶病毒2个分离物的亚组鉴定及株系分化研究

 基于黄瓜花叶病毒甜菜分离物CMV-XJ1和CMV-XJ2独特的生物学特性,利用RT-PCR对接种寄主植物进行了检测。RT-PCR产物的RFLP结果显示,2个病毒分离物的MspⅠ酶切图谱与CMV亚组Ⅰ病毒的酶切图谱很相似,但经EcoRⅠ酶切后出现显著差异;进一步对2个分离物的外壳蛋白基因进行了克隆,序列分析表明,CMV-XJ1和CMV-XJ2归属CMVIB亚组,二者存在着株系分化的趋势。     

鹰嘴豆象与四纹豆象的分子检测技术

结合聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和酶切方法,对鹰嘴豆象Callosobruchus analis(Fabricius)和四纹豆象Callosobruchus maculatus(Fabricius)的分子检测技术进行了研究。根据两种豆象m tDNACOⅠ基因序列的比对结果设计了2对特异性PCR引物,并筛选到2个特异性内切酶SnaⅠ和MboⅠ,通过PCR反应(最适退火温度为55℃)和PCR产物的酶切反应检测2个近缘种。可靠性检测表明,2对引物针对不同地理种群和个体以及不同DNA浓度的鹰嘴豆象和四纹豆象均能扩增出相应的目的条带。限制性内切酶验证结果表明,PCR技术具有较高的准确性和灵敏度,弥补了形态鉴定的不足。