ptsG基因敲除对肺炎克雷伯氏菌CCR效应的缓解及发酵产2,3-BD的影响

旨在解决Klebsiella pneumoniae在利用混合碳源发酵生产2,3-丁二醇（2,3-butanediol,简称2,3-BD）时会产生碳分解代谢抑制(Carbon catabolite repression,CCR)效应,导致生产效率下降的问题。本研究以Cm抗性基因为标记,采用λRed同源重组技术成功构建ptsG基因缺失菌株K. pneumoniae HD79-N。此外,在利用葡萄糖与木糖混合碳源（葡萄糖:木糖=2:1）发酵的结果显示,K. pneumoniae HD79-N菌株由于敲除ptsG基因显著减弱了CCR效应,使其能够同步利用葡萄糖与木糖生产2,3-BD且最终产量达9.81±0.38 g/L。同时,K. pneumoniae HD79-N[0.23±0.01 g/(L·h)]菌株木糖利用率也比K. pneumoniae HD79[0.15±0.00 g/(L·h)]菌株提高了57.82%。本研究结果为缓解ptsG基因对K. pneumoniae菌株的CCR作用及提升2,3-BD的产量提供技术参考。     

外源维生素对高NaCl胁迫下紫花苜蓿种子萌发及恢复性的影响

为给改进紫花苜蓿在盐碱地区的生产提供依据,笔者研究了14610 mg/L高浓度NaCl胁迫下,外源水溶性维生素（VB₁、VB₂、VPP、VB₆、VH、VB₁₂与VC）对紫花苜蓿种子萌发及恢复萌发性状的影响。结果表明：62.5 mg/L VPP显著提高了恢复萌发后的芽鲜重,1000 mg/L VB₆、500 mg/L VB₁₂和1000 mg/L VC促进了紫花苜蓿高盐胁迫下的萌发,但对胁迫减轻后的恢复萌发没有显著影响。250 mg/L VB₁₂对高盐胁迫下紫花苜蓿的萌发及恢复萌发均有显著性改进,使高NaCl的致死性从19.667%降低到4.667%。VB₁、VB₂和VH未能有效改进高NaCl胁迫对萌发的抑制效应。试验显示外源VB₆、VB₁₂、VC对高NaCl胁迫下紫花苜蓿种子的萌发特性有一定程度的调节作用。     

2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株的构建和初步鉴定

旨在过表达BudC进而上调2,3-丁二醇（2,3-Butanediol, 2,3-BD）的合成,通过基因工程手段构建整合载体pR1SW-BudC,经PCR和酶切双重验证后将其电转化至产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca) HD79。结果经卡那霉素筛选,获得一株菌株K. oxytoca HD79-01。以原始菌株为对照,摇瓶发酵检测2,3-BD含量和相关酶活,q RT-PCR检测BudC表达差异,最终BudC在HD79-01中转录水平的表达量为HD79的45.25倍（p<0.01）。摇瓶发酵显示2,3-BD的最高产量、转化率和生产强度分别提高了24.54%、10.97%、45.08%（分别为30.818 ± 0.003 g/L、0.253 ± 0.013 g/g、0.43 ± 0.01 g/(L·h)）,酶活提高了3.61倍(0.563 ± 0.003 U/mg)。因此,2,3-丁二醇脱氢酶基因(BudC)过表达菌株构建不仅成功的提高了2,3-BD的产量也为实现2,3-BD的工业化生产奠定基础。     

不同浓度的激素组合和有机物组合对甘薯脱毒苗快繁的影响

以甘薯一号脱毒试管苗为材料,研究了在MS基本培养基中添加不同浓度激素组合和有机物组合对其生长和快繁的影响。结果表明：各激素及有机物对甘薯脱毒苗生长指标总值的作用为6-BA>NAA>IAA和烟酸>肌醇>VB₁>甘氨酸>VB₆。激素及有机物最佳浓度组合分别为NAA（0mg/L）+6-BA（0.1mg/L）+IAA（0.1mg/L）和甘氨酸（3.0mg/L）+VB₁（0.6mg/L）+VB₆（0.25mg/L）+烟酸（100mg/L）+肌醇（1.00mg/L）,在此组合下,试管苗光照培养30d,形态指标总值和繁殖系数分别为25.52和24.98,达到最佳。     

药用植物白及组培苗瓶内复壮研究

对白及(Bletilla striata)试管苗进行复壮研究,以期解决其羸弱纤细、不利于生根培养及生根后成活率低等问题,同时优化复壮培养条件。在课题组已有的白及增殖及生根培养基配方中,分别添加不同质量浓度植物生长延缓剂多效唑(PP₃₃₃)和矮壮素(CCC)并改变培养基碳源浓度,以不同继代试管苗为材料,通过单因素和L₉(3⁴)正交实验研究不同材料和不同植物生长延缓剂种类及其质量浓度对试管苗复壮、繁殖生长、生根培养及驯化移栽的影响。实验表明,4代苗在MS+活性炭1.0 g/L+香蕉泥50 g/L+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.01 mg/L+ PP₃₃₃ 0.5 mg/L+CCC 0.1 mg/L+蔗糖40 g/L中获得最佳的复壮效果,培养70天后,试管苗基茎直径平均达(0.26±0.06) cm,繁殖系数2.13,假鳞茎发生率100%;复壮后的试管苗在1/2MS+活性炭1.0 g/L+香蕉泥80 g/L+ 6-BA 0.1 mg/L+ NAA 1.0 mg/L+蔗糖15 g/L中培养60天后,可获得具假鳞茎、根粗苗壮的再生植株,生根率100%;再生苗移栽成活率亦达100%。本研究完善了白及体外快繁及复壮条件,建立了高效的植株再生体系。     

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3菌株发酵特性研究

通过对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)WBG3进行菌株发酵特性的研究,旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。本研究采用摇瓶发酵法,改变发酵过程中的底物浓度、溶氧量和酸碱浓度,紫外分光光度法和高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测2,3-BD合成途径中关键中间产物(丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻)含量和发酵产物浓度。结果表明:S. cerevisiae WBG3菌株生长良好,在80 g/L葡萄糖、30℃和200 r/min条件下,丙酮酸、α-乙酰乳酸和乙偶姻含量分别达到0.10±0.03 g/L、3.38±0.06 g/L和0.17±0.02 g/L,乙醇转化率最低为0.44±0.02 g/g。添加乙酸后,甘油产量和乙醇转化率分别较对照组降低了9.5%和10%,2,3-BD的最终产量为0.36±0.02 g/L。因此,S. cerevisiae WBG3具备生产2,3-BD的潜力。     

一株高产纳豆激酶菌株的ARTP诱变育种及培养基的优化

旨在提高纳豆激酶发酵水平，扩大其作为新型的纤溶药物的生产应用。利用常温室压等离子体(ARTP)技术对一株产纳豆激酶的野生菌株P进行诱变；筛选获得一株具有稳定遗传性能的纳豆激酶优势突变株P501，纳豆激酶活力比野生菌株提高了1.02倍，通过单因素实验、响应面实验对P501产纳豆激酶的发酵培养基进行优化，得到最佳发酵培养基为：葡萄糖30 g/L、玉米粉40 g/L、豆粕粉30 g/L、Na₂HPO₄3 g/L、K₂HPO₄0.3 g/L、MgSO₄0.6 g/L、CaCl₂0.63 g/L、丝氨酸0.07 g/L、豆油0.61 g/L，经过验证实验，纳豆激酶活力最高为9691 Fu/mL，较基础发酵培养基提高了6.68倍。     

外源激素对沙米(Agriophyllum squarrosum)种子萌发的影响

为了筛选促进沙米种子萌发的最佳外源激素处理方法，用不同浓度的赤霉素(GA₃、GA₄₊₇)和ABA合成抑制剂氟啶酮(FL)进行浸种实验，分析外源激素浸种浓度和浸种时间对沙米种子萌发的影响。结果表明：(1)浓度为1.6 g/L GA₃、0.4 g/L GA₄₊₇和5.0μmol/L FL浸种效果最好，发芽率分别为93%、82%和100%，总体效果FL>GA₃>GA₄₊₇。(2)在适宜浓度下，0～24 h浸种时间内沙米种子的发芽率均随着外源激素浸种时间的延长呈增加趋势，浸种24 h发芽率最高。(3)在相同浸种时间下，FL浸种萌发率均高于GA₃和GA₄₊₇,FL能更快破除种子休眠，促使种子快速萌发。总之，外源激素浸种不仅能提高沙米的萌发率，也极大地缩短了沙米种子的萌发进程。     

平铺白珠种子萌发特性研究

为提高平铺白珠的繁殖效率,以采集的平铺白珠‘极速贵族’种子为供试材料,测量种子形态、千粒重、吸水特性;并通过培养皿滤纸萌发法统计不同GA₃处理和温度处理下种子的发芽率;将无菌萌发所获幼苗与常规播种苗长势进行对比。结果表明,平铺白珠‘极速贵族’种子属小粒种子(千粒重(0.2995±0.0111) g),种子种皮薄且透水性良好。GA₃浸种时间、GA₃浸种浓度和温度三者间存在交互作用,其中GA₃浓度和温度是影响种子萌发的关键因子,浓度为1000 mg/L的GA₃溶液浸泡种子12～24 h,环境温度为白天25℃、夜晚15℃的条件有利于促进种子萌发,种子发芽率可达90%以上,显著高于对照(64.67%)。无菌苗长势要优于常规播种苗,无菌萌发1500 mg/L GA₃预处理种苗的平均株高(12.17 mm)和平均根长(18.15 mm)均高于常规播种苗的株高(9.65 mm)和根长(13.31 mm),培养基配方为WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L ...     

赤霉素对盐胁迫抑制水稻种子萌发的缓解作用的蛋白质组分析

用粳稻日本晴(Oryza sativa L. cv.Nipponbare),研究了盐胁迫对水稻种子萌发的抑制作用和赤霉酸(GA₃)对盐胁迫的缓解作用;分别以H₂O (对照）,5 g L^-1 NaCl (处理I),5 g L^-1 NaCl + 100 μmol L^-1 GA₃(处理II)培养水稻种苗48 h,提取芽中的蛋白质,利用双向电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术分析了水稻蛋白质组的变化。结果表明,在盐胁迫条件下,日本晴种子的萌发显著受到抑制,而GA₃能显著缓解这种抑制作用;用ImageMaster软件分析2-DE凝胶,发现有4个蛋白质斑点表现出显著的变化,在盐胁迫下斑点S1、S2和S3表达下调而斑点S4消失,在GA₃与盐共处理时,这4个蛋白质点的表达均有不同程度的恢复;经MALDI-TOF MS分析,其中2个蛋白质斑点(S1,S3)分别被鉴定为isoflavone reductase-like蛋白与葡萄糖磷酸变位酶,这些蛋白可能与GA₃提高水稻耐盐性途径相关。     

外源添加乙偶姻对酿酒酵母W5/W141产2,3-丁二醇的影响

本研究旨在获得一株性能良好的2,3-丁二醇(2,3-BD)生产菌株。向酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) W5/W141两株产2,3-BD菌株中添加不同浓度乙偶姻,并测定2,3-BD、乙醇和甘油产量随发酵时间的变化情况。S. cerevisiae W5最适乙偶姻添加浓度为12 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为2.54±0.03 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了17.6%和23.6%。S. cerevisiae W141最适乙偶姻添加浓度为10 g/L,且2,3-BD的产量在72 h达到最大,产量为1.71±0.02 g/L,甘油和乙醇转化率分别较未添加时下降了57.1%和16.7%。通过对比,本课题最终选用S. cerevisiae W5作为最适菌株,为微生物发酵法生产2,3-BD提供新的资源。     

外源添加乙酸对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)产2,3-丁二醇影响初探

为验证乙酸作为信号分子的作用,本研究分别将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W141上清液(对照组)、W141-07 (△aldh6)上清液及1.5 g/L乙酸添加至对数生长期的W141发酵液中,检测2,3-BD产量、乙酰乳酸合成酶(ILV2)及2,3-丁二醇脱氢酶(BDH1)酶活。结果表明:当添加1.5 g/L乙酸时,2,3-BD产量、ILV2和BDH1酶活性均达到最高,分别为3.01±0.04 g/L、1.41±0.03 U/mg和0.12±0.002 U/mg,且较其余两组相比差异极显著(P0.01)。同时,测定3组条件下ilv2(24 h)和bdh1(60 h)基因的表达情况时发现,添加W141-07上清液后,ilv2和bdh1基因的表达量分别下调了31.6%和25.0%;而添加1.5 g/L乙酸后,ilv2和bdh1的表达量均发生上调,分别是对照组的4.38及1.24倍。表明乙酸可作为信号分子驱动相关基因的表达,进而提高2,3-BD产量。     

酿酒酵母培养条件及发酵培养基的优化

为了确定酿酒酵母的最适摇瓶发酵培养条件及最适培养基,采用单因素试验及L₉(3³)正交试验研究影响酿酒酵母生长的关键因素,包括培养温度、培养时间及摇床转速;采用单因素试验及L9(34)正交试验优化发酵培养基并进一步筛选出关键因素。结果表明：优化的培养条件为培养温度29℃,摇床转速160 r/min,培养27 h,优化的发酵培养基配方为葡萄糖20 g/L,酵母粉10 g/L,KH₂PO_{4sub> 1.5 g/L,MgSO4 1 g/L。结论：影响酿酒酵母生长的关键因素为摇瓶培养时间及培养基中葡萄糖浓度。}     

LC-MS/MS测定3种复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶虫脒及哒螨灵残留

为了探究目前蔬果生产中常用杀菌剂、杀虫剂、杀螨剂在复合蔬果汁中的残留情况,本研究建立了3种复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶虫脒和哒螨灵残留的LC-MS/MS分析方法。选取以不同蔬果进行调和的3种复合蔬果汁为材料,采用含1%(v%)乙酸的乙腈溶液提取,以SPE-NH₂柱进行净化,以C₁₈色谱柱分离待测物,采用电喷雾离子化,正离子扫描和多反应监测模式(MRM)检测,基质匹配标准溶液外标法定量。试验结果表明：啶虫脒在5~1000 μg/L,吡唑醚菌酯和哒螨灵在1~500 μg/L范围内均有良好的线性关系,相关系数(R²)在0.9984以上。添加浓度为0.010、0.10和0.50 mg/kg时,3种复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶虫脒及哒螨灵回收率为80.6%~113.4%;相对标准偏差(RSD)介于0.5%~9.3%之间;以最低添加浓度0.010 mg/kg为方法定量限(LOQ)。该方法快捷、简便、准确,满足复合蔬果汁中吡唑醚菌酯、啶虫脒及哒螨灵残留分析的要求。     

赤霉酸与杀菌剂处理对蒜薹贮存期品质的影响

研究旨在通过赤霉酸和杀菌剂处理,在降低蒜薹病害发生的同时较好地保持其品质。以金乡蒜薹为研究对象,分别设置赤霉酸GA₃ 50 mg/L(S2)、赤霉酸GA₄₊₇ 50 mg/L(S3)、赤霉酸GA₄₊₇ 25 mg/L(S4)、咪鲜胺800倍液(S5)、吡唑醚菌酯1500倍液(S6)、GA₄₊₇ 25 mg/L+GA₃ 25 mg/L(S7)、GA₄₊₇ 50 mg/L+咪鲜胺800倍液(S8)、GA₄₊₇ 25 mg/L+咪鲜胺800倍液(S9)、GA₄₊₇ 50 mg/L+吡唑醚菌酯1500倍液(S10)、GA₄₊₇ 25 mg/L+吡唑醚菌酯1500倍液(S11)10个处理,以浸泡清水作为空白对照(S1),采收后将薹苞部分放入药液中浸泡5 min,放入恒温冷库(0℃)中贮存,6个月后调查病害发生率,测定蒜薹的含水量,叶绿素、Vc、可溶性糖含量。与对照的结果比较,赤霉酸与杀菌剂能够抑制蒜薹贮存期病害的发生,发病率均抑制在20%以内;蒜薹含水量总体提高1.5%左右,Vc含量和叶绿素含量分别提高3.5、4.9 mg/100 g以上,可溶性糖含量提高2.0 mg/g左右,能够减缓蒜薹中水分、Vc、叶绿素和可溶性糖的损失。其中GA₄₊₇ 50 mg/L+咪鲜胺800倍液混剂效果最佳,各指标值均远高于对照,两者之间差异显著。研究表明,赤霉酸与杀菌剂处理能够有效降低贮存期蒜薹的发病率,减缓营养物质的流失,提高贮存后产品的质量和商品价值。     

胡桃楸幼苗生长和光合特性对配比施肥的响应

为筛选出胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)适合的施肥方案,为胡桃楸高效育苗技术研究提供依据,本研究根据L₉(3⁴)正交试验设计,进行3因子(氮,磷,钾) 3水平(N:9.2,18.4,27.6 g/m²;P:2.4,4.8,7.2 g/m²;K:9,18,27 g/m²)的配比施肥试验,以清水为对照,测定胡桃楸苗木的生长指标和光合特性,分析施肥处理下各指标之间的关系。结果显示：合理的配比施肥能够显著提高胡桃楸的苗高、地径、根长、侧根数、生物量和光合特性,除主根长外,所有指标各处理间存在显著差异(P<0.05)。N₃P₁K₃和N₃P₃K₂两种施肥处理的苗木生长较为理想,综合分析,胡桃楸的最佳施肥处理为N₃P₃K₂,此时的最佳氮磷钾施入量为施氮27.6 ...     

打顶后喷施不同浓度GA3和6-BA对烤烟农艺性状和化学成分的影响

以云烟87为试验材料,研究打顶后叶面喷施不同浓度的赤霉素（GA₃）和6-苄氨基嘌呤（6-BA）植物生长调节剂组合对烤烟生长和烟叶化学成分的影响。结果表明,在打顶当天喷施GA₃和6-BA可以增加烤烟叶面积,GA₃浓度为100mg/L、6-BA浓度为40mg/L时,烤烟叶面积增加最多;喷施GA₃和6-BA可以提高烟叶叶绿素含量,且随着二者浓度提高烟叶叶绿素含量呈增加趋势;外源GA₃和6-BA主要对碳氮化合物起调节作用,GA₃和6-BA联用可以提高烟叶中总糖、还原糖和钾含量,而单施6-BA则会引起烟碱含量升高,当GA₃浓度为50mg/L、6-BA浓度为40mg/L时,总糖和还原糖含量最高;不同浓度的GA₃和6-BA主要影响烟叶香味物质中的类胡萝卜素降解产物和新植二烯,当GA₃浓度为50mg/L、6-BA浓度为40mg/L时,烟叶中胡萝卜素降解产物和新植二烯等香味物质含量较高。     

滇红食用玫瑰茎段增殖培养基的试验筛选研究

植物组织培养育苗是解决食用玫瑰种苗市场紧缺的一种重要技术途径,但其中最为关键的问题是如何高效高质量地实现茎段增殖。以滇红食用玫瑰为对象,通过实施L₉(3⁴)正交试验,研究不同因素对玫瑰茎段增殖的影响规律,并分析筛选适宜茎段增殖的最佳培养基。结果表明：不同的试验处理,滇红食用玫瑰的茎段分化增殖差异较大,表现出了4 种主要的植物形态类型;基础培养基对茎段的增殖系数影响显著(P＜0.05),而6-BA、NAA 和GA₃ 3 个因素对茎段增殖系数的影响没有达到显著水平(P＞0.05),4 种因素对增殖系数影响的主次关系为：基础培养基＞6-BA＞NAA＞GA₃;最佳茎段增殖培养基为WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L+GA₃ 0.5 mg/L+白砂糖30 g/L,其具备的优点为茎段成株率高、植株高、笔直整齐、茎杆粗壮、节间较长、枝条多、节段数多、增殖系数大。研究结果可应用于滇红食用玫瑰的工厂化组织培养育苗。     

不同成胚能力的百子莲愈伤组织中氧化还原水平的差异分析

生长素类物质毒莠定(picloram,PIC)对宿根花卉东方百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)愈伤组织诱导及胚状体的形成至关重要,不同浓度PIC处理对百子莲愈伤组织(Callus)的成胚能力具有不同效应。本研究以在含1.0、1.5和2.0 mg/L PIC的MS培养基上继代的胚性愈伤组织(embryogenic callus,EC)为材料,以愈伤组织为对照,通过检测活性氧(reastive oxygen species,ROS)关键组分含量和3种抗氧化酶活性,明确不同浓度PIC处理下细胞内氧化还原动态变化对成胚能力的影响。结果显示：1.5 mg/L PIC处理的EC细胞状态较佳且成胚能力最强,1.0和2.0 mg/L PIC处理的EC具有成胚能力,但成胚率较低。EC中O₂·^-含量较高,均高于愈伤组织;1.5 mg/L PIC处理的EC中H₂O₂含量最高(为148.53μmol/g)是愈伤组织的38.50倍;愈伤组织中OH·含量极显著高于EC,为1.5 mg/...     

饲料维生素K3对大口黑鲈生长和健康的代谢转录调节机制研究

为了探究维生素K₃在大口黑鲈体内的可能作用机制，在基础饲料中分别添加不同水平的维生素K₃，配制成维生素K₃含量分别为0.78(K₃0组)、15.84 mg/kg(K₃15组)的试验饲料，运用代谢组学和转录组学的方法对平均初始体重为(12.96±0.07) g、摄食饲料8周后生长和健康程度差异显著的K₃0组和K₃15组大口黑鲈肝脏进行分析。共鉴定出712个差异代谢物，以K₃0组为对照，K₃15组有326个上调的差异代谢物，386个下调；将差异代谢物注释到KEGG数据库中，共有13个差异代谢物，其中7个上调，6个下调。参与的功能通路有23条。整合通路表明维生素K₃可通过L-丝氨酸调节鞘脂类代谢，也可通过壳寡糖调节糖类代谢。两组的差异表达基因在GO数据库中共有86个，参与的二级功能有26种。两组的差异基因在KEGG数据库中有29个，参与46条代谢途径。从肝脏代谢物和代谢通路的...