钙信号转导与缺氧诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞癌基因c-fos、c-myc表达的关系

利用细胞免疫组化、原位杂交技术研究钙信号与缺氧诱发肺动脉平滑肌细胞(PASMC)癌基因c-fos、c-myc表达的关系。结果显示,钙通道拮抗剂verapamil(V)、nifedipine(N)、Cyclosporin A(C)显著抑制缺氧引起的c-fos和c-mycmRNA的表达(其中c-fosmRNA:缺氧组198.1±32.8,缺氧 V组161.6±24.1,缺氧 N组173.7±35.8,缺氧 C组159.0±32.8,P<0.01;c-mycmRNA:缺氧组187.1±22.4,缺氧 V组150.5±22.6,缺氧 N组155.1±25.4,缺氧 C组148.9±29.7,P<0.01)。同时显著抑制缺氧引起的c-fos和c-myc蛋白的表达(其中c-fos蛋白:缺氧组225.9±37.0,缺氧 V组162.3±33.6,缺氧 N组157.4±28.9,缺氧 C组151.6±37.3,P<0.01;c-myc蛋白:缺氧组228.8±33.4,缺氧 V组170.2±26.7,缺氧 N组170.7±28.5,缺氧 C组179.1±29.2,P<0.01)。verapamil和nifedipine能够显著抑制缺氧引起的癌基因表达,表明钙信号转导参与了缺氧引起PASMC癌基因的表达过程。Cyclosporin A可显著抑制缺氧引起的癌基因的转录表达,表明钙信号转导系统中的Ca2 /CaM-CaN转导通路在PASMC增殖过程中具有重要作用。PASMC增殖是肉鸡腹水综合征的主要特征,钙信号转导激活引起PASMC增殖的c-fos和c-myc的转录表达,表明钙信号转导可能与肉鸡腹水综合征的发生发展密切相关。     

缺氧与肉鸡心肌细胞c-fos和c-myc基因表达的关系

利用细胞培养、原位杂交、免疫组化、图像分析等技术研究缺氧与肉鸡心肌细胞癌基因c-fos和c-myc表达的关系,进一步阐明缺氧与以右心肥大、衰竭为特征的肉鸡腹水综合征的关系。结果显示,缺氧显著引起心肌细胞内癌基因c-fos和c-mycmRNA的表达(c-fos mRNA:常氧149.6&#177;22.4;缺氧205.4&#177;57.6,P&lt;0.01;c-myc mRNA:常氧155.2&#177;25.7;缺氧197.4&#177;26.2,P&lt;0.01)。缺氧显著引起心肌细胞内癌基因c-fos和c-myc蛋白的表达(c-fos蛋白:常氧159.1&#177;37.1,缺氧240.3&#177;49.6;c-myc蛋白:常氧149.6&#177;24.9,缺氧236.3&#177;55.4;P&lt;0.01)。结果表明缺氧显著诱发肉鸡心肌细胞内癌基因c-fos、c-myc的转录和表达,是启动心肌细胞肥大的重要原因。因此本研究进一步阐明缺氧是以右心肥大衰竭为特征的肉鸡腹水综合征的主要诱因。     

钙信号转导与缺氧诱发肉鸡心肌细胞c-fos和c-myc基因表达的关系

利用细胞培养、免疫组化、原位杂交、图像分析技术研究钙信号与缺氧诱发心肌细胞癌基因c-fos、c-myc表达的关系,进一步阐明钙信号转导与以右心肥大衰竭为特征的肉鸡腹水综合征(AS)的关系。结果显示,钙通道拮抗剂异搏安(V)、硝苯吡啶(N)、环孢霉素A(C)显著抑制缺氧引起的癌基因c-fos和c-myc mRNA的表达(c-fosmR-NA:常氧149.6&#177;22.4;缺氧205.4&#177;57.6,缺氧+V151.3&#177;20.1,缺氧+N154.5&#177;25.2,缺氧+C 166.5&#177;22.1;c-myc mRNA:常氧155.2&#177;25.7;缺氧197.4&#177;26.2,缺氧+V 160.5&#177;19.4,缺氧+N 171.3&#177;25.4,缺氧+C158.9&#177;23.6)。同时显著抑制缺氧引起的癌基因c-fos和c-myc蛋白的表达(c-fos蛋白:常氧159.1&#177;37.1,缺氧240.3&#177;49.6,缺氧+V 165.2&#177;52.2,缺氧+N 166.5&#177;49.8,缺氧+C 190.8&#177;33.6;c-myc蛋白:常氧149.6&#177;24.9,缺氧236.3&#177;55.4,缺氧+V178.9&#177;42.1,缺氧+N174.4&#177;36.3,缺氧+C 16...     

组织贴块法培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞

建立组织贴块法培养原代和传代肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC).将1～10日龄雏鸡的肺动脉中膜切成小于1 mm2的组织块,用翻转干贴壁法进行贴块培养.采用形态学和抗α肌动蛋白抗体(α-actin)免疫组化染色法对所培养的细胞进行鉴定.倒置显微镜观察培养的细胞呈梭形,重叠生长,呈典型的"峰-谷"状.抗α-actin单克隆抗体免疫组化染色可见胞浆内有明显的细丝,呈现棕黄色,表明所培养的细胞为肺动脉平滑肌细胞.组织贴块法简便易行,可用于血管病理生理变化研究.     

缺氧条件下巨噬细胞移动抑制因子对肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

本研究旨在探讨缺氧条件下巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响。取14~16日龄鸡胚,改良酶消化法分离培养肺动脉平滑肌细胞。采用氯化钴作为化学缺氧模拟剂处理肉鸡肺动脉平滑肌细胞,以低氧诱导因子1α(HIF-1α)为缺氧指标,摸索合适的氯化钴使用浓度,构建细胞缺氧模型;在此基础上使用阻断剂ISO-1阻断MIF,比较阻断前后细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达水平和细胞增殖水平的变化。利用Western boltting检测各蛋白表达水平,利用MTT法及细胞计数方法来检测细胞增殖水平。结果显示:经800μmol/L CoCl2处理24 h后肺动脉平滑肌细胞,HIF-1α表达较正常对照组极显著升高;与正常组相比,缺氧组肺动脉平滑肌细胞MIF及CyclinD1表达均显著升高;与缺氧组相比,阻断剂ISO-1处理后肺动脉平滑肌细胞MIF及CyclinD1表达均极显著升高。综上,缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞MIF表达量增加,通过上调CyclinD1的表达来促进平滑肌细胞的增殖。     

5-羟色胺对肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

采用胶原酶消化法培养原代肉鸡肺动脉平滑肌细胞（PASMC）,检测不同浓度的5-羟色胺（5-HT）对肉鸡PASMC增殖的影响,并用流式细胞仪检测PASMC周期和凋亡情况。结果发现,10-4～10-7 mol/L的5-HT能剂量依赖性地促进肉鸡PASMC的增殖,可能是5-HT加速细胞从G1期向S期过渡,同时5-HT也可促进PASMC凋亡,因此在总体上5-HT促进PASMC增殖的作用更明显。     

缺氧、肺动脉高压、心脏功能与肉鸡腹水综合征的关系

为阐明缺氧、肺动脉高压、心脏功能与肉鸡腹水综合征 (ascites syndrome,AS)之间的关系 ,比较了正常肉鸡、亚临床腹水鸡和腹水鸡的右心室平均压 (m RVP)、平均肺动脉压 (m PAP)、心电图 导联 S波幅 (L ead S)、红细胞压积(HCT)、动脉血血氧饱和度 (Sa O2 )、心率 (HR)和右心肥大指数 (RV/ TV) ,并对这些指标进行相关分析和回归分析。结果表明 :在 AS的发展过程中 ,m RVP、m PAP、L ead S、HCT和 RV/ TV逐渐升高 ,HR和 Sa O2 逐渐下降 ;各指标相互之间的相关性都很高 (P<0 .0 0 1) ;HCT发生变化较其他指标早。此外 ,亚临床腹水鸡的左心室和体质量的比值 (L V/BW)及全心室和体质量的比值 (TV/ BW)最高 ,与腹水鸡的 L V/ BW值差异显著 (P<0 .0 5 ) ;正常鸡的 TV/ BW最低 ,与亚临床腹水鸡的差异显著 (P<0 .0 5 )。结果说明肺动脉压升高与机体慢性缺氧有关 ,且是造成右心肥大衰竭和 AS的原因 ;AS发展早期肉鸡心脏功能是代偿性增加的 ;m RVP、m PAP、L ead S、HCT和 Sa O2 可作为早期诊断、预测AS的指标。     

维拉帕米对环境低温诱发肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖的作用

环境低温诱发肉鸡腹水综合征(AS)发生过程中,肺血管发生明显重塑,并以肺动脉中膜增厚为主要特征。血管平滑肌细胞的数量将影响血管中膜的厚度[1]。故推测认为肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖在肺血管重塑过程中起着重要作用。研究认为细胞内的Ca2 是重要的细胞内第二信使,在细胞增殖过程中起着重要的作用。维拉帕米作为一种钙通道阻滞剂,可抑制Ca2 内流,使细胞内Ca2 水平降低,对肉鸡AS的发生有明显的预防作用[2]。但有关维拉帕米对环境低温诱发肉鸡AS过程中肺动脉血管平滑肌细胞增殖的作用,未见报道。增殖细胞核抗原(proliferating cell nucle…     

肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌中CaSR的表达

肉鸡肺动脉高压是以肺动脉压血管重构为特征的一种疾病,众多研究揭示肺血管重构是其中心环节之一。细胞内钙离子([Ca2+])浓度的升高是诱发并导致血管重构的重要机制,钙敏感受体(CaSR)在肺动脉平滑肌细胞内钙离子稳态失调及低氧性肺血管收缩和肺血管重构中起着重要的作用。应用免疫组化和Western blot方法研究了缺氧条件下CaSR在AA肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌组织中的表达情况,为肉鸡腹水综合征(PAH)的肺动脉重构提供新的证据。结果表明,肉鸡组有肺水肿发生,藏鸡组无肺水肿发生,缺氧条件下饲养的肉鸡肺动脉平滑肌CaSR表达明显高于藏鸡组(P0.05)。通过探讨CaSR在AA肉鸡和藏鸡肺动脉平滑肌组织中的表达情况,从新的角度阐明了肉鸡腹水综合征发生的分子机制。     

低温诱发肉鸡腹水综合征过程中肺动脉平滑肌细胞增殖的变化

本试验旨在研究低温诱发肉鸡腹水综合征(AS)过程中平滑肌细胞增殖在肺血管重塑过程中的动态变化,初步探讨肺血管重塑的机制。160只15日龄雄性AA商品代肉鸡随机分为对照组(22℃±1.5℃)和低温组(11℃±2℃)。试验持续至50日龄,期间每周每组随机取6只,取肺组织做石蜡切片,Weigert-间苯二酚复红染色,观察并测定血管重塑情况;采用免疫组织化学方法检测肺动脉增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达,并对其半定量化,分析平滑肌细胞增殖情况。50日龄时统计整个饲养过程中AS发生率。结果显示:(1)低温组肉鸡AS发生率(18.75%)极显著高于对照组(1.25%)(P<0.01);(2)低温组肉鸡直径20-50μm和50-150μm肺动脉结构从36日龄开始较对照组发生了明显的重塑(P<0.01或P<0.05);(3)低温组肉鸡直径20-50μm和50-150μm的肺动脉平滑肌细胞增殖指数分别从22日龄和36日龄开始极显著高于对照组(P<0.01)。结果表明:低温诱发肉鸡AS过程中肺动脉结构发生了明显的重塑,肺动脉平滑肌细胞发生了明显的增殖,并且平滑肌细胞增殖促进了肺血管重塑,在肉鸡AS发生发展过程中起着重要的作用。     

酶消化法分离培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞

试验旨在探讨胶原酶消化法分离并培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞(pul monary artery smooth muscle cell,PASMC)的方法。将1～7日龄雏鸡的肺动脉中膜剪成小于1 mm2的组织块,0.1%Ⅱ型胶原酶消化分离PASMC并进行原代培养和传代培养。倒置显微镜下观察培养细胞的形态,对培养细胞进行HE染色和光学显微镜观察,并采用抗α-肌动蛋白单克隆抗体(α-Smooth muscle actin)免疫组化染色法检测细胞胞浆内α-肌动蛋白的表达,用以鉴定所培养的细胞。结果表明,倒置显微镜下细胞为长梭形,呈典型的"峰—谷"状,未见明显异型细胞。α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的97%以上。因此,胶原酶消化法可用于分离培养肉鸡PASMC,且有方法简单,成活细胞数多、传代周期短的特点,可用于肉鸡心血管疾病如肺动脉高压和肺血管重构的研究工作。     

L-精氨酸对肺动脉高压肉鸡肺小动脉平滑肌细胞凋亡的影响

将240羽14日龄艾维茵-2000商品代肉鸡于14d时随机等分为常温对照组（NT组），低温组（LT组）和低温加L-精氨酸组（LA），白14d起，LT和LA组舍内温度从28℃以1～2℃／d的速度下降，至21d降至12～14℃，并维持到试验结束。此外，LA组自14d起在饲料中按100mg／kg剂量添加L—Arg，直至试验结束。记录肺动脉高压综合征（PHS）发病率，并分别于24、32、39和45d测定右心室／全心室质量比（RV／TV）、血浆NO、肺小动脉管壁面积／管总面积（WA／TA）和平均中膜厚度（mMTPA），并用原位缺口末端标记法（TUNEL法）对肺小动脉凋亡平滑肌细胞进行染色和计数。结果：LT组肉鸡PHS发病率、RV／TV、mMTPA和WA／TA值较NT组升高（P〈0．05）；LA组肉鸡PHS发病率较LT组降低（P〈0．05），mMTPA和WA／TA值与LT组相比呈下降趋势，在32d时显著降低（P〈0．05）；LT组血浆N0浓度总体上与NT组差异不显著（P〉0．05），仅在39d时降低（P〈0．05），而LA组血浆N0浓度自32d时起较NT和LT组显著升高（P〈0．05）；LA组肉鸡肺小动脉平滑肌凋亡细胞百分率较NT组和LT组均显著升高（P〈0.05），但LT组与NT组之间相比无显著差异（P〉0．05）。上述结果表明，L-Arg／NO通过促进肺小动脉平滑肌细胞凋亡，从而在一定程度上抑制了肺血管重构的形成。     

环境低温和T3对肉鸡内皮素、一氧化氮和肺动脉压的影响

20 0只 AA肉鸡随机等分为对照组 (C)和试验组 (T) ,C组和 14日龄前 T组鸡按常规饲养。 T组自 14日龄起舍温从 2 5℃起每天降 1～ 2℃逐渐降至 12℃ ,同时在日粮中按 1.5 m g/ kg的剂量添加三碘甲腺原氨酸 (T3 )以诱发肺动脉高压综合征 (PHS)。分别于 2 1、2 8、35、42、49日龄测定 2组肉鸡平均肺动脉压 (m PAP)、红细胞压积 (PCV)、右心全心比 (RV/ TV)、血浆内皮素 (ET- 1)及一氧化氮 (NO)水平 ,同时记录 PHS发病率。结果显示 ,试验组肉鸡 m PAP升高 ,PHS发病率增加 ;PCV、RV/ TV及血浆 ET- 1水平与对照组相比都显著升高 (P<0 .0 1) ;m PAP变化与血浆 ET- 1含量变化之间存在显著正相关 ,2组间血浆 NO水平无显著差异 (P>0 .0 5 ) ,但都出现随日龄增加血浆 NO水平升高的现象。     

金霉素和代谢物差向金霉素在肉鸡肌肉和肝脏中的残留分布

为了研究金霉素(CTC)、差向金霉素(ECTC)在肉鸡肌肉、肝脏中的残留分布情况,样品经提取液提取后过Oasis HLB SPE小柱净化,采用电喷雾正离子模式(ESI+)和多反应监测模式(MRM),用高效液相色谱-串联质谱仪检测;试验组鸡按体重以50 mg/(kg·d)剂量内服CTC,连续5 d,每天给药1次。结果表明:该方法测定肉鸡肌肉和肝脏中CTC检测限和定量限分别为5.0、10.0μg/kg。ECTC检测限和定量限分别为20.0、30.0μg/kg。CTC和ECTC在肉鸡肌肉中平均回收率分别在73.0%~95.20%和81.80%~101.60%,相对标准偏差(RSD)分别在8.85%~12.18%和2.05%~9.29%;在肉鸡肝脏中平均回收率分别在67.06%~90.80%和78.64%~106.98%,RSD分别在2.90%~8.88%和4.72%~9.48%;肉鸡肌肉和肝脏中CTC、代谢物ECTC的残留量分别在给药后第1、5 d时达到最高。肉鸡肝脏中ECTC的残留量约占总残留量的1/2。停药后CTC及其代谢物ECTC代谢缓慢,在停药第6 d时,仍能检测到CTC及其代谢物ECTC,但其残留量均低于最高残留限量(MRLs)。从保障食品安全方面考虑,建议我国将CTC和ECTC均作为金霉素的残留标示物进行监测。     

12周龄大围山微型鸡与艾维茵肉鸡肌肉营养成分及LPL基因表达差异研究

为研究云南地方鸡种大围山微型鸡与艾维茵肉鸡肌肉营养成分中粗脂肪含量与脂蛋白脂酶(LPL)基因mRNA表达差异,屠宰同批12周龄大围山微型鸡和艾维茵肉鸡各20只,测定肌肉营养成分含量和LPL基因表达量。结果显示:在胸肌和腿肌中,大围山微型鸡粗灰分含量、粗蛋白含量、粗脂肪含量均显著高于艾维茵肉鸡,在胸肌和腿肌中大围山微型鸡水分的含量显著低于艾维茵肉鸡,且胸肌和腿肌中大围山微型鸡LPL基因表达量分别为3.98、5.72,均高于艾维茵肉鸡的3.70、3.54。可见,大围山微型鸡肌肉粗蛋白、粗脂肪等营养成分优于艾维茵肉鸡,LPL基因促进脂肪沉积,因此LPL基因可作为影响家禽脂肪沉积的重要候选基因。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养

本试验旨在体外分离培养兔子宫内膜细胞(腺上皮细胞和基质细胞)和平滑肌细胞,并且探讨纯化子宫内膜上皮细胞和基质细胞的方法。用差速离心法和差速贴壁法获得纯化的子宫内膜上皮细胞和基质细胞,用滤网法分离得到子宫平滑肌细胞,分别在添加20%胎牛血清(FBS)、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L雌二醇(E2)、7.14nmol/L孕酮(P4)的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2的饱和湿度条件下培养;用免疫组化和免疫荧光法鉴定细胞并检测分离的细胞纯度。结果表明用该方法成功地分离培养了兔子宫内膜上皮细胞和基质细胞,且2种细胞纯度都达98%左右,基质细胞出现蜕膜化;子宫平滑肌细胞的纯度为97%左右,而且出现横纹状的生长。本研究表明子宫内膜细胞和平滑肌细胞能够在体外成功培养;在含20?S、100μg/mL牛胰岛素、63.5 nmol/L E2、7.14 nmol/L P4的DMEM/F12(1∶1)培养液和37℃5%CO2饱和湿度的培养条件下最有利于体外培养的子宫内膜细胞和平滑肌细胞的生长。