暗黑赤眼蜂低温贮存技术研究

旨在对暗黑赤眼蜂低温贮存技术进行研究,以期为规模化繁殖的暗黑赤眼蜂低温贮存提供依据。利用清水、0.5%盐水、1.0%盐水、1.5%盐水和直接冷藏等方式处理被暗黑赤眼蜂寄生的麦蛾卵,研究其低温贮藏技术。结果表明：与对照相比较,0.5%、1.0%和1.5%盐水处理后能够显著提高暗黑赤眼蜂的羽化率、降低其羽化畸形率;45 天以内,各浓度盐水处理的暗黑赤眼蜂单雌产卵量与对照之间差异不显著,表明在此时间内利用盐水处理可显著保持暗黑赤眼蜂的单雌产卵量;冷藏90 天后,暗黑赤眼蜂雌雄比例开始增大,75 天后,暗黑赤眼蜂的雌雄比例失调较为严重。研究表明：冷藏时间的增加不利于暗黑赤眼蜂各项指标的发育,但0.5%、1.0%和1.5%盐水处理后能在一定程度上减少负面影响,是羽化率、羽化畸形率、雌虫寿命、单雌产卵量和雌雄比例等指标的有利因素。     

抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体可变区的原核表达

为了在大肠杆菌中表达抗鹅细小病毒(GPV) NS1蛋白单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,并测定其与NS1蛋白结合活性。对抗GPV NS1蛋白单克隆抗体VL、VH基因核苷酸序列依据大肠杆菌偏爱密码子进行优化,人工合成获得了含有可变区基因的重组质粒pUC57-VL和pUC57-VH。然后用Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切pUC57-VL、pUC57-VH,回收340 bp的VL基因和370 bp的VH基因。目的基因通过Bam HⅠ/XhoⅠ多克隆位点分别插入至原核表达载体pET-32a,获得重组质粒pET-VL和pET-VH。重组质粒经Bam HⅠ单酶切和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导,获得了重组蛋白TRX-VL和TRX-VH的表达,分子量分别为30.3,31.4 ku。纯化后的重组蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性结合,鉴定结果表明,获得的纯化蛋白为目的蛋白。间接ELISA分析表明,0.4μg的TRX-VH可与25 ng的GST-NS1蛋白特异性结合而0.4μg的TRX-VL不能与各包被量的GST-NS1蛋白特异性结合,TRX-VH与GST-NS1蛋白的特异性结合可被1∶200稀释的GPV感染鹅血清完全阻断。     

室温半干法制备木薯氧化淀粉的研究

以双氧水为氧化剂,CuSO4为催化剂,常温半干法制备木薯氧化淀粉。考察了氧化剂用量、催化剂用量、反应时间和水用量对氧化淀粉羧基含量的影响。结果表明较佳反应条件为:双氧水用量10%,催化剂用量0.16%,反应时间9h,水用量30%。在此优化条件下反应,氧化淀粉羧基含量可达1.55%。     

绵羊FecB基因的原核表达及其抗体制备

为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。     

小麦ATG8的原核表达及其抗血清制备

提取小麦品种L10的总RNA,进行反转录,其产物用于探究自噬基因ATG8的生物学功能.用PCR方法克隆ATG8,将克隆的ATG8亚克隆至表达载体PMD19-T,酶切后切胶回收,然后把产物测序鉴定,转化宿主菌E.coli Rosetta-gami B(DE3),构建原核表达系统,将融合蛋白纯化后制备其兔抗血清,然后利用Western Blotting技术对兔抗血清进行检测,鉴定了该抗血清的结合特异性.ATG8抗体的成功制备,为小麦中ATG8基因和自噬功能的研究奠定了基础.     

木薯品种生长发育及淀粉积累特性研究

1998－1999年对SC124、GR911、GR891、SC205、南洋红（CK）几个木薯品种的生长发育及淀粉积累特性进行研究。结果表明，SC124种茎发芽快、出苗早、出苗整齐、出苗率高、长势旺盛、植株不分枝或极少分枝、适应性强、比较耐寒、结薯多、块根较长而且大、产量高、块根淀粉含量也较高，GR911种茎发芽快、出苗早、出苗率高、生长势旺盛、植株高大、茎秆粗壮、不分枝或极少分枝、适应性强、结薯习性好、结薯集中、容易收获、块根粗大、产量高、淀粉含量也较高。GR891植株较矮、分村以多、出苗率、生长势适中、结多、块根大小比较均匀、产量较高、块根淀粉积累早、淀粉含量高、氢氰酸含量低、食性好。SC205种茎发芽较快、出苗率较高、植株不分枝或极少分枝、适应性强、结薯习性好、结薯较多而且集中、容易收获、产量和淀粉含量也较高。     

小麦胚乳14-3-3蛋白的表达及其淀粉体淀粉合成酶的互作

从小麦胚乳中克隆了14-3-3基因,并将其分别插入pET29c和pET41c质粒,用热激法转化大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP,得到高效表达的蛋白,但融合蛋白主要以包涵体的形式存在。可溶性的融合蛋白可直接通过S-蛋白琼脂糖树脂纯化。包涵体经8 mol L^-1尿素溶解变性,稀释复性后,结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,也得到纯化的融合蛋白。复性后的融合蛋白对蔗糖合成酶活性表现抑制作用,说明包涵体14-3-3融合蛋白恢复活性。将结合14-3-3融合蛋白的S-蛋白琼脂糖树脂作为诱饵与小麦胚乳淀粉体提取液进行亲和杂交,与14-3-3蛋白特异互作的淀粉合成酶结合到S-蛋白琼脂糖树脂上,Western 检测结果表明, 淀粉体淀粉合酶I(SSI)、淀粉合酶II(SSII)、淀粉分支酶IIa(SBEIIa)、淀粉分支酶IIb(SBEIIb)和ADP焦磷酸化酶大亚基(SH2)与14-3-3蛋白存在互作,而淀粉分支酶I(SBEI)、淀粉磷酸化酶(SP)、D-酶(DE)和ADP焦磷酸化酶小亚基(BT2)不能与14-3-3蛋白结合,说明小麦胚乳14-3-3蛋白对淀粉体淀粉合成具有一定的调控作用。     

棉花GhCOMT3基因的原核表达、纯化及鉴定

为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结果表明,pET-28a-GhCOMT3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达产物,为在蛋白水平上研究GhCOMT3基因功能奠定了基础。     

抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-x L能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-x L与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为c DNA,设计引物以c DNA为模板,PCR扩增Bcl-x L基因,构建p UM19-T-Bcl-x L质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-x L引物,以测序正确的p UM19-T-Bcl-x L质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-x L序列,将扩增序列克隆入p ET28a载体,构建PTD-Bcl-x L蛋白的原核表达质粒p ET28a-PTD-Bcl-x L,并对p ET28a-PTD-Bcl-x L载体双酶切鉴定和测序鉴定;将p ET28a-PTD-Bcl-x L重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切p UM19-T-Bcl-x L质粒出现约774 bp大小条带,p UM19-T-Bcl-x L质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建p UM19-T-Bcl-x L质粒;双酶切p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒出现约744 bp大小条带,p ET28a-PTD-Bcl-x L质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p ET28a-PTD-Bcl-x L原核表达载体;在IPTG诱导下p ET28a-Bcl-x L重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 k Da大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-x L蛋白。纯化得到了PTD-Bc L-x L融合蛋白,推进了PTD-Bcl-x L蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。     

锦鲤疱疹病毒ORFl基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus Virus,KHV）诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORFl基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌E．coliBL21（DE3）后诱导表达,再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS．PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37．3KD,为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1：27000。表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CryIA单克隆抗体的制备及在转Bt基因棉毒蛋白检测上的应用

用苏云金杆菌菌株HD-1和HD-73分别发酵培养制备了孢晶混合物，孢晶混合物经分离、纯化、电泳得到CryIA、CryIA(c)杀虫晶体蛋白。用CryIA和CryIA(c)分别免疫家兔制备了两种多抗。用CryIA免疫小鼠，经细胞杂交、融合、克隆后筛选出4个单克隆株系A4F5F11、B4E6C7、B4E6D8、B4F5G11。用CryIA(c)多抗包被，B4E6D8上清液作为夹心抗体成功地建立了双抗夹心 ELISA，并检测了中棉所30、NUCOTN33B蕾期叶片中毒蛋白的含量，结果分别为23．4ng·g-1 FW、24．7ng·g-1 FW。     

新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及其抗原捕捉ELISA方法的建立

为建立一种快速的新城疫病毒病原检测方法。本研究以原核表达的重组HN蛋白免疫7周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了1株能稳定分泌抗新城疫病毒HN蛋白的McAb杂交瘤细胞,命名为4E8,4E8亚类鉴定为重链属于IgG2a,轻链属于κ链。以多克隆抗体作为包被抗体、单克隆抗体4E8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测新城疫病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法对EDSV、ITLV、IBV、IBDV不发生交叉反应,其敏感性比HA试验要高4倍以上,与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为95.6%、93.3%、96.1%。本研究建立的NDV AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于新城疫病毒感染的早期诊断。     

齿兰环斑病毒CP基因的原核表达及其产物抗血清制备

本研究在于探讨侵染兰花的重要病毒之一齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）的检测技术。从福建省漳州市采集感染齿兰环斑病毒的建兰病样,设计一对特异性引物扩增并克隆得到该病毒的外壳蛋白基因,该基因开放阅读框长477 bp,编码158 aa约合18.0 kDa的蛋白质,随后将目的基因插入pET-29a（+）中构建相应的原核表达载体进行诱导表达,目的蛋白经纯化后免疫家兔获得了特异性抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ORSV外壳蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附检测结果表明,抗血清可检测病叶的最低稀释度达1:25600（v/v）,最佳工作浓度为1:12800（v/v）,病汁液灵敏度为0.195 mg/mL（w/v）,而与TMV等11种同源或异源病毒均无明显的血清学交叉反应。     

性别决定基因Sry原核表达载体的构建和蛋白检测

动物的性别在畜牧业是一项很重要的经济性状,而哺乳动物的性别决定受睾丸决定基因Sry的启动,获得SRY蛋白并探索它与其他相关因子之间的相互关系对于深入了解该因子的作用机理和寻求高效经济的性别控制方法尤为重要。本研究以小鼠为实验材料,通过PCR、质粒重组、酶切和测序等方法构建小鼠Sry的原核表达载体,使用IPTG诱导蛋白表达、SDS-PAGE电泳和western blotting等方法检测重组表达载体的原核表达。PCR、酶切和测序结果一致显示成功地构建了原核表达载体pET-21b-Sry;使用anti-Sry和anti-His特异性抗体进行的western blotting实验结果验证了蛋白表达的正确性。本实验不仅实现了哺乳动物性别决定因子的Sry原核表达,而其还获得了具有生物活性的SRY蛋白,对于深入研究Sry及其他相关基因的相互作用奠定了实验基础。     

百合发育过程中鳞茎淀粉含量及SP活性变化

为探讨百合鳞茎内淀粉含量与淀粉磷酸化酶(SP)活性变化的关系,以亚洲百合和兰州百合为试材,对鳞茎发育过程中母鳞茎、新鳞茎内淀粉含量以及SP活性的变化进行测定。结果表明,2种百合母鳞茎淀粉含量展叶期前均呈下降趋势,而后迅速升高,展叶后40天达到最大值,之后2种百合淀粉含量均下降,亚洲百合下降趋势较为明显;新鳞茎淀粉含量总体呈上升趋势,其中亚洲百合新鳞茎淀粉含量在枯萎期达到最大值,而兰州百合在植株半枯期达到最大值。百合发育过程中淀粉的积累与SP的含量呈正相关,发育过程中2种百合淀粉含量的变化趋势与SP变化趋势基本一致,但鳞茎内淀粉含量最大值与SP活性高峰并非同步出现,说明SP与百合鳞茎淀粉合成有关,却非参与合成淀粉的唯一酶。     

溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核载体构建、表达条件优化及多克隆抗体制备

为构建水产致病菌溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核表达载体,优化ACFA蛋白的诱导表达条件,制备ACFA蛋白小鼠多克隆抗体。通过分子克隆获得ACFA蛋白的表达菌株,利用切胶纯化获得ACFA蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度为1∶3 200倍,Western-Blotting法检测抗血清特异性较好。通过正交试验,获得ACFA菌株的最佳表达条件为:诱导时菌液OD600值0.5,加IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时间8 h,诱导温度32℃;最佳培养条件为:葡萄糖浓度0,转速230 r/min,装液量50 m L。     

变性淀粉与胶体复配使用对裹粉品质的应用效果研究

对比4种不同变性淀粉对裹粉的应用效果。结果表明,木薯氧化羟丙基淀粉效果最好,木薯氧化淀粉、木薯羟丙基二淀粉磷酸酯、木薯羟丙基淀粉较好,木薯醋酸酯淀粉次之,且以面粉为主要原料,添加20%木薯氧化羟丙基淀粉、0.1%羧甲基纤维素钠(CMC)、0.1%魔芋精粉、0.1%明胶复配制作的裹粉应用效果最好,大大改善产品的外观、颜色及口感,减少了其他增稠剂的添加量,从而降低了成本,提高产品的产出率。