母水牛唾液中N—乙酰—β—D氨基葡萄糖苷酶活性变化与排卵时间的关系

对１６头年龄６－１８岁１－６胎的母长水牛作了试验。全部试畜在发情期内其唾液中均存在Ｎ－乙酰－β－Ｄ氨基葡萄糖苷酶（ＮＡＧ）。未排卵时ＮＡＧ活性单位为１９．２５±５．８５；临排卵前ＮＡＧ活性出现峰值，为５１．６９±１４．７５单位。未排卵时和临近排卵时发情母水牛唾液中的ＮＡＧ活性的差异显（Ｐ＜０．０１）。掌握这一信号可提高受胎率。     

飞蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表达及酶学特性分析

【目的】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析,探究该酶在飞蝗(Locusta migratoria)生长发育过程中的生物学功能,为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据Lm NAG1的cDNA全长序列(Gen Bank:JX888720.1)设计包含酶切位点Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ和6×His标签的引物。采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段,双酶切后连接至pFast Bac~(TM)-Dual载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上,用蓝白斑结合抗生素筛选。挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带,挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid,Bacmid)。用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9中,72 h内连续观察细胞形态,当出现感染迹象后收集细胞,离心,取上清得到P1代重组病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞,裂解并提取蛋白,Western blot检测目的蛋白是否成功表达。之后大量感染Sf9细胞,提取蛋白,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化,取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度。采用4MU-GlcNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定。【结果】克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全长的pFast Bac-LmNAG1重组质粒,酶切验证与目标条带一致。将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,PCR扩增挑选出纯白斑,成功将LmNAG1全长序列构建到杆状病毒基因组上。将重组Bacmid转染至Sf9细胞,72 h后在显微镜下观察可见细胞膨大,边缘不规则等感染迹象。离心收集重组病毒粒子感染新的Sf9细胞,72 h后收集细胞,Western blot检测发现在67 kD附近有明显条带,与LmNAG1的理论分子量一致,获得带6×His标签的融合蛋白。大量感染收集细胞提取蛋白,经Ni-NTA琼脂糖层析纯化,进一步透析除盐后用阴离子交换柱Q二次纯化,得到了高纯度的目的蛋白。用Bradford法测定最纯的E3组分的蛋白浓度为0.057μg·μL~(-1)。体外活性测定结果表明LmNAG1的最适pH为8.0,且在pH 6.0—8.0范围内具有较高的稳定性;LmNAG1的最适温度为40℃,在40℃以下具有很高的稳定性,当温度高于45℃时热稳定性迅速下降;采用4MU-GlcNAc为底物测得LmNAG1具有水解β-1,4糖苷键的活性,可以释放出4MU,它的动力学参数K_m值为(0.28±0.02)mmol·L~(-1),K_(cat)值为(902.88±38.15)s~(-1)。【结论】成功获得高纯度且具活性的LmNAG1蛋白,其可水解β-1,4糖苷键连接的几丁质寡糖,与已知昆虫NAG1具有相似的生物学功能,即参与几丁质的降解。     

母水牛同期发情中多卵泡发育的排卵监测

用"GnRH+PGc+GnRH"法同期化处理水牛,利用B超对多卵泡发育和排卵进行监测。结果表明,经同期化处理的母水牛多卵泡发育发生率为6.43%(42/653),排卵率为72.73%(24/33)。母水牛多卵泡发育的发生与品种、年龄、季节等因素无关。     

猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的纯化与酶学性质研究

 【目的】分离纯化猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂,研究其理化性质。【方法】采用硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32阴离子交换柱层析、Sephadex G-100分子筛柱层析和CM-52阳离子交换柱层析方法,分离纯化猪精液的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定和酶分子量测定;采用聚丙烯酰胺等电聚焦圆盘电泳法测定酶的等电点。【结果】经分离纯化获得比活力为17 606.15 U•mg-1、纯化倍数为270.53倍的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂。酶催化对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖（pNP-NAG）水解的最适pH为5.5,最适温度为50℃。该酶在pH 3.0～8.9区域较稳定;在45℃以下处理30 min,酶活力保持稳定。酶分子中亚基的分子量为58.03 kD,等电点为9.42。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为1.94 mmol•L-1,最大反应速度Vm为27.53 µmol•L-1•min-1。酶催化pNP-NAG反应的活化能为88.73 kJ•mol-1。【结论】本试验选用的分离纯化的方法是可行的。     

河田鸡与艾维茵肉鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特性比较

河田鸡和艾维茵肉鸡的睾丸,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-32离子交换柱层析,获得比活力为54.84 U.mg-1,纯化倍数为8.86的河田鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)制剂.艾维茵肉鸡睾丸NAGase经Sephacry S-300凝胶过滤层析柱进一步纯化,获得比活力为171.50 U.mg-1,纯化倍数为19.8倍的NAGase制剂.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:河田鸡和艾维茵肉鸡睾丸NAGase的最适pH分别为5.6、5.7,最适温度分别为55、50℃;NAGase分别在pH为3.0-9.2、4.0-9.2及温度为10-60、10-30℃下能保持稳定;NAGase酶促反应动力学均符合米氏双曲线方程,测得米氏常数(Km)分别为0.223、0.319 mmol.L-1,最大反应速度(Vm)分别为9.438、6.238μmol.L-1.m in-1;NAGase催化pNP-NAG反应的活化能分别为85.74、73.47 kJ.mol-1.     

单糖对猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

以D-果糖、葡萄糖、D-甘露糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)为效应物,研究它们对猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.3.1.52)活力的影响及抑制机理.结果表明:在特定浓度范围内,低浓度的葡萄糖对NAGase活力表现为激活作用,而D-果糖、D-甘露糖和NAG对酶活力均表现为抑制作用,抑制程度从高到低依次为D-甘露糖、NAG、D-果糖;D-甘露糖表现为可逆的竞争型抑制,抑制常数KI为18.36 mmol·L-1;NAG表现为可逆的混合型抑制,抑制常数KI和KIS分别为16.98和55.26 mmol·L-1.     

大型潘N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶纯化产物的动力学特性

为制备免疫原以测量个体生长和繁殖过程中所释放的几丁质酶,从大型潘（Daphniamagna）体内提纯了N．乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（EC3．2．1．52）,经硫酸铵沉淀分级分离、DEAESephadex A-25阴离子交换柱层析和SephadexG-150分子筛柱层析纯化等步骤,酶的纯化倍数为20．09。纯酶比活力为2243380U·mg^-1。酶分子中各亚基的分子量分别为128,99和71Ku。根据测试,酶促反应的米氏常数为0．300mmol·L～,最大反应速度为0．072um01．mg^-1·min^-1。酶催化底物分解的最适pH为7．0,最适反应温度为45℃;酶在值4．2-7．8的范围内活性处于高位;在不高于35℃的温度下处理30min,酶活性下降不明显。至于从大型潘培养液中获得的NAGase,其催化底物分解的最适pH值为7．4,最适反应温度为40℃,该酶在pH值4．6-7．8的范围内活性处于高位,在不高于40℃下处理30min,酶活性下降不明显。这显示被提纯的酶和培养液中分离的酶在温度、pH以及热稳定性和酸碱稳定性方面均具有较高程度的相似性,有可能属于相同分子型。     

河田鸡与艾维菌肉鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特性比较

河田鸡和艾维菌肉鸡的睾丸,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-32离子交换柱层析,获得比活力为54．84U·rag～,纯化倍数为8．86的河田鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）制剂．艾维菌肉鸡睾丸NAGase经SephacryS-300凝胶过滤层析柱进一步纯化,获得比活力为171．50U·mg-1,纯化倍数为19．8倍的NAGase制剂．以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（pNP-NAG）为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学．结果表明：河田鸡和艾维菌肉鸡睾丸NAGase的最适pH分别为5．6、5．7,最适温度分别为55、50℃;NAGase分别在pH为3．0—9．2、4．0-9．2及温度为10-60、10-30℃下能保持稳定;NAGase酶促反应动力学均符合米氏双曲线方程,测得米氏常数（k）分别为0．223、0．319mmol·L-1,最大反应速度（k）分别为9．438、6．238μmol·L-1·min-1;NAGase催化pNP-NAG反应的活化能分别为85．74、73．47kJ·mol-1．     

有机溶剂对中国明对虾体壁N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

以中国明对虾体壁N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)为研究对象,探讨10种有机溶剂对酶活力的影响。结果表明:甲醇、乙醇、正丙醇、乙二醇、丙三醇、二甲亚砜、二氧六环和丙酮对NAGase的作用均表现为低体积分数时有一定的激活作用,高体积分数时转化为抑制作用;而正丁醇在0%~55%范围对NAGase表现为激活作用;甲醛对NAGase的抑制作用则呈现明显的浓度效应。进一步研究甲醛和丙酮对NAGase的作用机理,结果显示:甲醛对NAGase的抑制作用是一个可逆过程,而低体积分数丙酮对NAGase的激活作用和高体积分数丙酮对NAGase的抑制作用均属于可逆过程。说明不同有机溶剂对NAGase活力有不同的影响,NAGase在不同体积分数有机溶剂中的催化作用存在差异性。     

醇、醛类有机物对中华绒螯蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

以甲醇、乙醇、异丙醇、甲醛和戊二醛为效应物,研究它们对中华绒螯蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明:戊二醛对NAGase活力影响不大;低浓度的甲醇和乙醇对NAGase有激活作用;高浓度的甲醇、乙醇、异丙醇和甲醛对NAGase的作用为可逆抑制.甲醇、乙醇、异丙醇对NAGase表现出竞争性抑制,抑制常数(KI)分别为3.663、0.360和0.480 mol.L-1;甲醛表现为非竞争性抑制类型,其KI为0.288 mol.L-1.     

亚硫酸钠、过氧化氢和尿素对河蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

以亚硫酸钠(Na2SO3)、过氧化氢(H2O2)和尿素为效应物,研究它们对河蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明,Na2SO3、H2O2和尿素对酶活力有不同程度的抑制作用.Na2SO3和H2O2对酶的抑制均表现为可逆反竞争性类型,它们对游离酶的抑制常数(KI)分别为254.00和136.78 mmol.L-1;尿素对酶的抑制表现为可逆的混合型抑制,它对游离酶的KI和对酶—底物复合物的抑制常数(KIS)分别为379.02和1182.00 mmol.L-1.     

菊花总黄酮对凡纳滨对虾N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的效应

为菊花在凡纳滨对虾健康养殖、疾病预防和饲料添加方面的开发利用提供参考,通过乙醇回流法提取菊花总黄酮,以提取物为效应物研究其对凡纳滨对虾N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响。结果表明:菊花总黄酮提取物对NAGase活力具有明显的抑制作用,其抑制作用属可逆的竞争型抑制,抑制常数KI为0.35mg/mL。     

醇、醛类有机物对中华绒螯蟹N-乙酰毋-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

以甲醇、乙醇、异丙醇、甲醛和戊二醛为效应物，研究它们对中华绒螯蟹N·乙酰·归国·氨基葡萄糖苷酶（NAGase）活力的影响．结果表明：戊二醛对NAGase活力影响不大；低浓度的甲醇和乙醇对NAGase有激活作用；高浓度的甲醇、乙醇、异丙醇和甲醛对NAGase的作用为可逆抑制．甲醇、乙醇、异丙醇对NAGase表现出竞争性抑制，抑制常数（K）分别为3．663、0．360和0．480mol·L^-1；甲醛表现为非竞争性抑制类型，其K1为0．288mol·L^-1．     

公水牛外周血浆睾酮和17β—雌二醇水平与其繁殖性能的关系

应用 RIA 对公水牛(n=23)血浆睾酮(T)和17β—雌二醇(17β—E_2)水平进行了研究。犊牛(5—6月龄)的 T 值最低,为66.7±20.9pg/ml(±S.D);其后逐月增加,10月龄为122.8±26.9Pg/ml;20—24月龄为152.9±24.4pg/ml;成年牛为1112.8±170.4Pg/ml 结合外部观察,发现水牛在10月龄最早出现性行为;20—24月龄出现一般性欲,说明 T 是促使性成熟和性行为表现的必要条件。20—24月龄17β—E_2为7.4±1.3pg/ml,成年牛为7.9±0.6pg/ml。在5,9月份同一时间昼夜间隔2小时和2小时内间隔20分钟取样,T 和17β—E_2的分泌没有明显的季节性变化。     

山麻鸭睾丸和肝脏中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离提取及其性质的比较

山麻鸭的睾丸和肝脏经硫酸铵分级沉淀分离、DEAE-32离子交换柱层析,获得的肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)比活力为85.30 U.mg-1,纯化倍数为10.48.睾丸NAGase再进一步通过Sephacryl S-300凝胶过滤纯化,获得的NAGase比活力为5537.00 U.mg-1,纯化倍数为59.20.睾丸NAGase经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳,出现单一蛋白带,测定等电点pI为5.05.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:山麻鸭睾丸和肝脏NAGase的最适pH分别为5.70和5.60,酶在pH为3.00-8.43时较稳定,而pH>8.43时很快失活;酶的最适温度分别为45和60℃,当温度为80℃时酶完全失活.睾丸NAGase在40℃下处理30 min,酶活力保持稳定;而肝脏NAGase在30℃下处理30 min,酶活力保持稳定,酶催化pNP-NAG水解反应遵循米氏方程,睾丸和肝脏NAGase水解pNP-NAG的Km分别为0.17和0.21 mmol.L-1,Vm分别为8.82和7.25μmol.L-1.min-1,活化能分别为57.57和79.47 kJ.mol-1.     

沼泽型水牛促卵泡素基因β亚基的克隆与序列分析

根据GenBank公布的奶牛FSHβ亚基的编码序列设计1对特异性引物,成功克隆出广西沼泽型水牛FSHβ亚基cDNA,并将其序列提交到GenBank,获得接受号为EF710660。以DNA Star生物分析软件对其同源性进行分析,结果表明,广西沼泽型水牛与已公布的印度水牛（Bubalus bubalis）的FSHβ亚基cDNA序列的同源性最高,达99%,与绵羊（Ovis aries）为96%、牛（Bovine）为95%、山羊（Capra hircus）为95%、梅花鹿（Cervus nippon）为95%。     

LRH—A_3提高水牛第一情期受胎率的研究与推广

本文将LRH—A_3在信阳水牛上应用4年(1989～1992),筛选出了用于提高第一情期受胎率的最适宜剂量(200μg/头),推广应用1330头,第一情期受胎率(51.58％)极显著地高出对照组(26.24％)。     

山麻鸭睾丸和肝脏中N-乙酰够-D-氨基葡萄糖苷酶的分离提取及其性质的比较

山麻鸭的睾丸和肝脏经硫酸铵分级沉淀分离、DEAE-32离子交换柱层析,获得的肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase,EC3．2．1．52）比活力为85．30U·mg-1,纯化倍数为10．48．睾丸NAGase再进一步通过Sephacryl S-300凝胶过滤纯化,获得的NAGase比活力为5537．00U·mg-1,纯化倍数为59．20．睾丸NAGase经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳,出现单一蛋白带,测定等电点p,为5．05．以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（pNP—NAG）为底物研究酶催化底物水解的反应动力学．结果表明：山麻鸭睾丸和肝脏NAGase的最适pH分别为5．70和5．60,酶在pH为3．00—8．43时较稳定,而pH〉8．43时很快失活;酶的最适温度分别为45和60℃,当温度为80℃时酶完全失活．睾丸NAGase在40℃下处理30min,酶活力保持稳定;而肝脏NAGase在30℃下处理30min,酶活力保持稳定,酶催化pNP．NAG水解反应遵循米氏方程,睾丸和肝脏NAGase水解pNP-NAG的K分别为0．17和0．21mmol·L-1,k分别为8．82和7．25p．mol·L-1·min-1,活化能分别为57．57和79．47kJ·mol-1．     

浅谈提高母水牛冷配受胎率的技术与措施

牛的冷配改良早已成为提高牛良种化程度的主要技术手段,德宏州最先开展黄牛冷配改良起于上世纪70年代末,又于90年代中后期借中-欧德宏水牛开发项目利用摩拉水牛和尼里·拉菲水牛的冻精开展水牛的杂交改良