融合液浓度梯度融合法不同融合条件对延边黄牛体细胞克隆效率的影响

采用延边黄牛耳皮肤成纤维细胞作供核细胞,0.28 mol/L蔗糖融合液,融合液浓度梯度融合法对重组卵母细胞进行融合操作,探讨不同融合电场强度、脉冲次数、脉冲时程对延边黄牛体细胞克隆胚胎融合率及重组胚体外发育率的影响。结果表明,适宜延边黄牛体细胞克隆、融合液浓度梯度融合法的融合电场强度为1200 v/cm;融合脉冲次数为2次;融合脉冲时程为40μs。     

甘氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,研究了在体外培养液中添加不同浓度的甘氨酸对重组胚发育的影响。分别在体外培养液中添加0、7、14、21mmol/L的甘氨酸,结果表明,在体外培养液中添加甘氨酸能够显著提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,且以7mmol/L浓度的甘氨酸囊胚的发育率最高。     

聚合嵌合法制作黄牛和水牛种间嵌合胚的初步研究

通过聚合嵌合法初步建立一套黄牛和水牛种间嵌合的程序与方法。聚合嵌合法采用链酶蛋白酶消化透明带或用机械剥离法去除透明带，然后在含有100 μg/ml PHA的培养液中聚合形成嵌合胚。结果发现， 8-细胞黄牛胚胎聚合水牛桑椹胚与黄牛囊胚聚合水牛桑椹胚相比，聚合胚存活率和囊胚发育率均无显著差异（P>0.05）。采用显微手术法分离黄牛和水牛8-细胞胚胎卵裂球进行聚合，聚合率为92.3%，囊胚发育率为58.3%，与用0.25%链酶蛋白酶分离胚胎卵裂球进行胚胎聚合的聚合率（86.7%）和囊胚发育率（46.2%）均无显著差异（P>0.05）。以上结果表明：①水牛和黄牛胚胎通过卵裂球聚合获得的种间嵌合胚胎能继续发育；②胚胎聚合前的发育阶段对其聚合成功率和随后的胚胎发育无明显影响。③胚胎卵裂球的分离方法（显微手术法和酶消化法）对其聚合率和囊胚发育率无明显影响。     

换液培养对猪卵母细胞的成熟及胚胎体外发育的影响

通过后期去除激素培养比较了卵丘卵母细胞成熟及构建克隆胚后的发育情况,同时孤雌胚胎和体外受精胚胎体外培养48 h后全量换液,比较了其卵裂率和囊胚率之间的差异。结果显示,卵丘卵母细胞培养22h后换成不含激素的成熟培养液继续培养至44 h,其成熟率与对照组无显著差异(P0.05);后期克隆胚胎卵裂率和囊胚率与对照组均无显著差异(P0.05)。孤雌胚胎换液培养卵裂率高于未换液组,囊胚率低于未换液组,但差异均不显著(P0.05)。体外受精胚胎换液培养卵裂率以及囊胚率和未换液组差异不显著(P0.05)。本实验结果说明换液培养对卵母细胞的成熟及后续的体细胞克隆胚发育无显著影响,孤雌和体外受精胚胎换液培养对后期发育也无显著影响。     

聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白对牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的影响

为了比较不同浓度的聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白(BSA)对牛卵母细胞体外成熟率、重组胚卵裂率和发育率的影响,试验采用抽吸法回收卵母细胞,用不同的无血清成熟液进行卵母细胞的体外成熟培养,然后对成熟卵母细胞进行核移植、融合、激活以及胚胎的体外培养.结果表明,适合延边黄牛卵母细胞成熟及体细胞克隆胚胎发育的PVA、PVP和BSA的最佳浓度分别是1.0 mg/mL,0.3%和0.4%.     

显微操作液中添加抗氧化剂对延边黄牛体细胞克隆效率的影响

在延边黄牛体细胞克隆显微操作液中添加了维生素E,L-半胱氨酸,牛磺酸3种抗氧化剂,分别测定它们对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响,以确定显微操作液中添加的最佳浓度的最佳抗氧化剂,从而提高体细胞克隆的效率。结果显示,维生素E,L-半胱氨酸,牛磺酸3种抗氧化剂的最佳浓度分别为100μmol/L,0.9 mmol/L,14 mmol/L。适宜延边黄牛体细胞克隆显微操作液中添加的抗氧化剂为14 mmol/L的牛磺酸。结论:显微操作液中添加抗氧化剂能够提高延边黄牛体细胞克隆效率。     

自由基吸收类抗氧化剂对延边黄牛体细胞克隆重构胚发育的影响

为提高延边黄牛体细胞克隆重构胚发育率,研究了在体外培养液中单独添加不同浓度的自由基吸收类抗氧化剂维生素E(VE)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和亚硒酸钠(SS)对克隆重构胚发育率的影响。试验中选择成熟培养20～22h的卵母细胞,脱颗粒细胞后选择排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核操作,然后将融合、激活后的重构胚在添加不同种类不同浓度抗氧化剂的体外培养液中进行培养。结果表明,在卵裂率上,VE的100μmol.L-1组显著高于其他3组(84.58%vs 57.64%、70.87%、67.64%);50和200μmol.L-1组之间无差异,但都显著高于0μmol.L-1组(70.87%、67.64%vs 57.64%)。EGCG的7.5和15μmol.L-1组显著高于加0μmol.L-1组(79.47%、81.67%vs 69.47%)且其他2组间差异不显著。SS的添加,5ng.mL-1组与0和10ng.mL-1组有显著差异(80.44%vs 70.27%、67.16%);与2.5ng.mL-1组差异不显著(80.44%vs 73.92%),且其他2组间差异不显著;在囊胚发育率上,VE的100μmol.L-1组要显著高于其他3组(26.36%vs 13.04%、18.08%、17.26%)。EGCG的15μmol.L-1组显著高于0和30μmol.L-1组(24.86%vs 8.99%、12.10%),和7.5μmol.L-1组无差异。SS的5与0组和10ng.mL-1组有显著差异(23.31%vs 10.32%、12.65%);2.5ng.mL-1组与0和10ng.mL-1l组有显著差异(19.97%vs 10.32%、12.65%)且其他2组间差异不显著。体外培养液中分别单独添加浓度为100μmol.L-1、15μmol.L-1和5ng.mL-1的维生素E,EGCG和亚硒酸钠都能够显著提高延边黄体细胞克隆牛重构胚的发育率。     

水牛徒手克隆胚胎培养及冷冻条件的优化

本试验利用微滴、微穴和平板培养系统对徒手克隆(hand-made clone,HMC)重组胚进行体外培养;采用了40% EG(ethylene glycol,EG)、25% EG＋25% DMSO(dimethylsulphoxide,DMSO) 和20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为玻璃化冷冻液对HMC囊胚进行了超低温冷冻;并且比较了HMC与传统核移植的胚胎生产效率及囊胚冷冻存活率。结果表明,微穴系统的卵裂率要显著高于平板系统(P<0.05),极显著高于微滴系统(P<0.01);且微穴系统的囊胚率(40.0%)极显著高于平板(19.8%)和微滴系统(8.3%)(P<0.01)。采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为冷冻保护剂时HMC囊胚存活率极显著高于40% EG(P<0.01);HMC重组胚的融合率和囊胚率均高于传统核移植法(P<0.05;P<0.01),而HMC囊胚的冷冻存活率与传统核移植生产的囊胚没有显著差异。以上结果说明水牛HMC可以替代传统核移植法生产克隆胚胎,微穴体系最适合水牛HMC胚胎的体外培养,且采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖对HMC囊胚进行玻璃化冷冻可以取得良好的冷冻效果。     

不同电融合参数及融合液对昆明小鼠2-细胞胚胎融合及囊胚率的影响

四倍体胚胎在研究哺乳动物配子发生、发育、四倍体的发生、遗传、免疫机制等方面具有重要作用,因此提高融合及发育效率至关重要。为找出适合小鼠2-细胞胚胎融合的最佳方案,试验采用两种融合液0.3mol/L甘露醇溶液和0.3mol/L蔗糖溶液,两种融合液均采用了120V/mm,20μs×2、100V/mm,40μs×2、80V/mm,80μs×2三种电融合参数。其中采用0.3mol/L甘露醇溶液作为融合液且融合参数采用80V/mm,80μs×2获得了92.5%的融合率和90.6%的囊胚率,是小鼠2-细胞胚胎融合的最佳方案。     

不同分割液对水牛胚胎分割效果的影响

探讨了3种不同分割液PBS、PBS+0.2 mol/L蔗糖和PBS+5%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)对水牛胚胎分割效果的影响。借助显微操作仪,将体外受精培养的水牛桑椹胚(第5天)和囊胚(第6～7天)分割,体外培养半胚,观察其发育情况。结果显示:在PBS+0.2 mol/L蔗糖与PBS+5%PVP中分割桑椹胚,其分割成功率显著高于PBS(71.67%,67.26%,55.44%)(P<0.05),而半胚的囊胚发育率及囊胚细胞数三者均无差异显著性(P>0.05);在PBS+0.2 mol/L蔗糖与PBS+5%PVP中分割囊胚,其分割成功率显著高于PBS(79.13%,76.73%,65.25%)(P<0.05),而半胚培养的囊胚发育率及囊胚细胞数三者差异均无显著性(P>0.05)。说明在PBS中分别添加0.2 mol/L的蔗糖和5%的PVP有利于提高水牛桑椹胚和囊胚的分割成功率。