PEG分级法检测绿竹叶片双向电泳中的低丰度蛋白

蛋白质组学研究的关键问题之一是双向电泳(2-DE)中低丰度蛋白的分析,主要是因为相关高丰度蛋白的存在,导致IPG胶条无法吸胀低丰度蛋白,使得低丰度蛋白在2-DE中很难被检测出来。利用梯度浓度的PEG4000沉淀方法来富集绿竹叶片中不同丰度的蛋白质,从而使得低丰度蛋白在凝胶中显现出来。在PEG分级法和传统的全蛋白提取法的2-DE比较中,发现采用PEG分级沉淀法提取的蛋白质的数量以及类别明显增加,高丰度蛋白主要富集在8%和16%的PEG浓度组分中,使得其他组分中的低丰度蛋白与高丰度蛋白组分分别进行2-DE分析。经过对图像和数据的比较、分析,PEG分级法得到的5个组分蛋白点总数超过了1032个,大约是传统蛋白提取方法制备蛋白样品的3倍。     

绵羊卵母细胞蛋白质组2-DE图谱的构建及初步分析

[目的]获得绵羊卵母细胞蛋白质组表达图谱。[方法]采用直接裂解法制备卵母细胞蛋白样品,采用Bradford法和Ramagli法测定绵羊卵母细胞蛋白质样品的浓度,并进行双向凝胶电泳,运用PDQuest8.0对2-DE图谱进行初步分析。[结果]Ramagli法能更准确地测定绵羊卵母细胞蛋白质样品的浓度,从而优化样品的上样量,得到更高质量的2-DE图谱;Bradford法测得的绵羊卵母细胞蛋白质浓度偏高。[结论]700个卵母细胞的上样量比较合理,可用于构建卵母细胞蛋白质组2-DE图谱。     

适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立

[目的]建立适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)技术,为开展番茄蛋白质组学研究奠定技术基础.[方法]对番茄叶片蛋白质提取方法、蛋白质裂解液、上样量、胶条pH范围等关键步骤进行优化.[结果]采用三氯乙酸／丙酮法提取番茄叶片总蛋白质,含有7 moL/L尿素,2 mol/L硫脲,4; CHAPS,30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解缓冲液,上样量为100 mg,以pH 4 ～7、18 cm的IPG胶条在12; SDS-PAGE凝胶浓度下进行双向电泳,得到了蛋白点均匀分布、低峰度蛋白点较为清晰,蛋白点数目多且分辨率高的2-DE图谱.[结论]建立了一套适于番茄叶片蛋白质分析的双向电泳技术体系,为下一步在蛋白组学水平上分析番茄逆境胁迫等相关蛋白提供了技术支持.     

分蘖洋葱叶片总蛋白提取与双向电泳条件优化

以分蘖洋葱叶片为试验材料,比较3种不同蛋白质提取方法对2-DE蛋白质双向电泳结果的影响,并对其中的蛋白上样量、SDS-PAGE凝胶浓度及双向电泳重复性进行筛选与优化。结果表明,与酚提取法和改良的酚提取法相比,TCA-丙酮提取法提取分蘖洋葱叶片总蛋白的操作简便,所得双向电泳图谱背景清晰,蛋白质点圆滑,数量及质量均较好,是一种切实可行的提取分蘖洋葱叶片总蛋白方法。应用Image Master 2D Platinum 7.0软件对图谱进行分析,凝胶上检测到超过650多个蛋白质点,不同凝胶之间蛋白质的匹配率达92.5%,具有较高的分辨率和重复性,建立一套适用于分蘖洋葱叶片总蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)方法。     

果梅花芽蛋白质双向电泳优化体系的建立

以果梅花芽为材料,比较了TCA/丙酮法和酚抽法2种总蛋白质提取方法对蛋白质双向电泳(2-DE)的影响,同时对IPG胶条种类、凝胶浓度、蛋白质上样量及染色方法等环节进行了优化.结果表明:TCA/丙酮法比酚抽法在2-DE凝胶图谱上的蛋白质点数增多,图谱背景也比较清晰,没有明显的纵横条纹;采用17 cm pH 4～7的胶条、10％的凝胶浓度、1.5～1.8 mg的蛋白质上样量,经改良胶条考马斯亮蓝G-250染色后可获得背景清晰、重复性好、蛋白质分辨率高的2-DE图谱.高质量的果梅花芽蛋白质提取方法和蛋白质双向电泳体系的优化可为果梅蛋白质组学研究奠定技术基础.     

甘蓝型油菜根系可溶性蛋白的提取及双向电泳体系的优化

以甘蓝型油菜品种青油10号幼苗期根系为材料,采用三氯乙酸/丙酮沉淀法、酚提法及酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法分别提取甘蓝型油菜根系可溶性蛋白.以牛血清蛋白为标样,使用Bradford法测定蛋白质浓度,计算蛋白提取率,并对所提取的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及双向电泳(2-DE)检测,所得2-DE凝胶图...     

两种花吊丝竹叶片蛋白提取方法的2-DE比较

以2年生花吊丝竹的扦插苗为研究材料,对2种方法(TCA/酚提结合法和PEG法)提取的蛋白质的2-DE差异进行研究.结果表明:PEG法的5个组分的条带差异明显,全蛋白得到了有效分离,在F3中富集到了2条高丰度蛋白带;2种方法的2-DE图谱的均一性分析发现,PEG法中F3富集了高丰度蛋白,提高了2-DE中蛋白质的检测率和分辨率,PEG法中F1-F5共检测的蛋白总数超过了1700个,但是相邻组存在一定的重叠率,而TCA丙酮/酚提结合法只检测到约571个蛋白点,5个组与NF平均有439个蛋白点匹配,达到77.9%以上;质谱鉴定了5种差异蛋白,生物信息学分析发现这5种蛋白是糖酵解、糖异生和ATP合成的重要辅酶.2种方法的比较发现,PEG法能够将花吊丝竹叶片全蛋白中高丰度蛋白单一富集在16%的组分中,从而显著提高了2-DE的分辨率,再通过质谱技术能够检测到更多的影响生物体生长发育的低丰度蛋白,所以PEG法是一种切实可行的且较为理想的蛋白质提取方法.     

杜鹃叶片3种蛋白质提取方法的比较

以映山红(R.simsii)、马银花(R.ovatum)、满山红(R.mariesii)和云锦杜鹃(R.fortunei)4种杜鹃为实验材料,采用TCA-丙酮法、酚法和TCA-丙酮-酚法3种蛋白质提取方法提取杜鹃叶片蛋白质,并应用双向电泳技术(2-DE)比较分析不同方法的蛋白质提取率、溶解性、完整性等的差异,确立适用于2-DE分析的杜鹃叶片蛋白质提取方法。结果表明,TCA-丙酮法提取的蛋白溶解性差且粘稠,得到的蛋白质点少,不适合杜鹃叶片蛋白的提取;酚法提得的蛋白质溶解性好,蛋白质点多,但是杂质较多,且此法不适用于映山红叶片蛋白的提取;TCA-丙酮-酚法提取的杜鹃叶片蛋白质位点较多且清晰,重复性也好,且4种杜鹃叶片蛋白的提取效果都比较好。因此,TCA-丙酮-酚法被认为最适于杜鹃属植物叶片蛋白质的提取及分析。     

白桦雄花序发育初期蛋白质的双向电泳图谱分析

对发育初期2个时期的白桦雄花序进行的蛋白质双向电泳(two-dimemional electrophoresis，2-DE)研究结果表明，2个时期的2-DE图谱，有275个蛋白点在表达上有明显的质和量的变化。其中：162个蛋白点在5月31日雄花序2-DE图谱中的表达量均高于5月28日，110个蛋白点的表达量低于5月28日；2个蛋白点为5月28日雄花序2-DE图谱所特有；1个蛋白点为5月31日雄花序2-DE图谱所特有。这些结果为进一步获得与雄花序发育时期的相关蛋白，进而得到相关的特异基因，在分子水平上揭示白桦雄花序发育机理奠定重要基础。     

耐盐性不同的大豆品种幼苗的蛋白质组学比较研究

为了探讨大豆品种耐盐性的抗性机理,应用蛋白质组学技术,对耐盐大豆品种Lee68和盐敏感大豆品种N2899萌发期幼苗的蛋白质组成进行比较分析。用三氯乙酸/丙酮法提取大豆幼苗的蛋白质,双向电泳技术分离,考马斯亮蓝染色,在pH 4.0～7.0的2-DE胶上平均可检测到约650个的蛋白质点。比较Lee68和N2899幼苗的2-DE图谱,有52个差异表达蛋白点。选取6个蛋白质点,用MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹图谱,搜索大豆UniGene库,成功鉴定出4个蛋白质,分别是GST 9、GST 10、种子成熟蛋白PM36和26 ku未知蛋白;并对这些蛋白质在耐盐性不同品种中可能作用进行讨论。