深绿木霉1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶基因的克隆及表达

以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153为试材,应用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶ACCD基因的c DNA全长。结果表明:此基因的c DNA编码区序列全长1 083 bp,编码区可编码360个氨基酸。经Blast P相似性分析,其属于Try-synth-beta-Ⅱ家族,与里氏木霉(T.reesei)氨基酸序列XP-006967764的同源性最高,达到91%。在5种不同诱导条件下,ACCD基因的表达量均有明显变化。在C、N饥饿培养基中分别培养8 h与16 h时,ACCD基因表达量达到最大值,为未诱导时的22.7倍与22.4倍;在山新杨叶粉与茎粉的诱导下,ACCD的表达量分别在培养的24 h与2 h达到最大,为未诱导的22.6倍与27.3倍。     

华山松疱锈病的重寄生真菌(深绿木霉)中几丁质酶基因cDNA片段的克隆

[目的]分离深绿木霉S5003中的几丁质酶基因,为获得高抗病的转基因植株奠定基础。[方法]采用华山松疱锈病的锈孢子壁作为诱导物,诱导深绿木霉SS003中几丁质酶基因的表达,并通过lit—PER方法扩增得到几丁质酶基因片段。[结果]锈孢子壁可诱导出高活性（40．17μg／10min）的几丁质酶,PCR扩增得到了长度为834bp的特异片段,经序列测定及分析显示该片段为几丁质酶基因片段。[结论]深绿木霉SS003的几丁质酶基因片段的获得,为分离全长基因以及进一步利用该基因生产几丁质酶以及进行基因转化提供了可能。     

康宁木霉cbh2基因的克隆与结构特征分析

克隆得到了康宁木霉AS3.2774的cbh2基因组DNA及cDNA,序列测定表明:基因组DNA全长1583 bp,cDNA全长1413 bp。对比cbh2基因组DNA序列与cDNA序列,证明该基因由4个外显子组成,被3个内含子间断隔开,编码470个氨基酸的多肽。利用Predictprotein软件预测,该蛋白由9个α螺旋结构和10个β折叠结构及其他结构组成,并对其纤维素结构区、2个糖苷水解酶家族6的特征结构区、信号肽等特征性结构区进行了定位。     

生防木霉SS003菌株(Trichoderma atroviride)的固体发酵工艺研究

为了探索酷绿木霉SS003菌株固体发酵产孢子的较优工艺条件.分别以酷绿木霉SS003菌株为供试菌和以玉米秸秆、麦麸发酵基质,分别进行了固体发酵培养基配方和固体发酵条件的优化筛选,试验设计均采用单因索试验.试验最终检测方法采用血球计数板倍量稀释法镜检孢子量(108个/g).分别获得了酷绿木霉SS003菌株产孢固体发酵的较优培养基配方和较优固体发酵条件,即80目的玉米秸秆与麦麸配比1:3,接种1×106个/mL的SS003孢子液,保持含水量55％和充分通气,培养11d后,酷绿木霉SS003菌株固体发酵产孢量达到最大(76.14×108个/g).初步探索到绿木霉SS003菌株固体发酵产孢的较优工艺条件,为该菌的深入研发提供了有益的试验数据.     

安氏隐孢子虫ABC2基因的克隆表达与营养物质转运

为探究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒转运蛋白基因(CaABC2)对营养物质的转运功能,以安氏隐孢子虫基因组作为模板,设计合成CaABC2基因特异性引物,进行PCR扩增,获得CaABC2基因。将克隆的重组质粒CaABC2基因与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切后再连接,构建重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2;再采用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-C1-CaABC2转入小鼠肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC),检测不同组IEC细胞对总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的转运效果。结果表明:扩增出778bp的CaABC2基因,测序分析与预期片段大小一致;重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2转染小鼠IEC细胞后,观察到转染后的对照组和转染组IEC有绿色荧光;检测到在细胞内液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别为15.99±0.12、11.80±0.35和12.43±0.16 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为15.24±0.44、10.48±0.35和11.04±0.75mmol/L;在细胞外液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别10.67±0.17、14.82±0.06和15.84±0.17 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为10.20±0.79、14.60±0.45和15.60±2.50mmol/L。转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽浓度均显著大于空白组和对照组(P0.05),而在细胞外液中,转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度均显著小于空白组和对照组(P0.05)。在细胞内液和外液中,空白组与对照组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度之间均未见显著性差异(P0.05);转染组、对照组和空白组之间的葡萄糖和碱性磷酸酶浓度均没有统计学差异(P0.05)。CaABC2基因具有协助转运总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的作用,其中转运总胆固醇效果最为明显。     

绿木霉(Trichoderma virens)T23甲基转移酶基因gliN-T对胶毒素合成的调控研究

为探明绿木霉(Trichoderma virens)胶毒素合成的分子调控机制,本研究以绿木霉菌T23为研究对象,对农杆菌介导的遗传转化技术(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)进行改良,并利用改良的ATMT技术对绿木霉菌T23胶毒素合成候选基因簇中的甲基转移酶基因gliN-T进行基因敲除,通过薄层色谱法及高效液相色谱法分析基因敲除突变体培养液中的胶毒素含量变化情况,明确gliN-T对胶毒素合成的调控作用。结果表明:在绿木霉菌T23分生孢子液中添加终浓度为15mg/mL的细胞壁裂解酶(Glucanex),30℃处理2～3h后用于农杆菌介导的遗传转化,每106个孢子转化子数从0.25个提高10个;利用改良的ATMT技术,成功获得基因敲除突变体ΔgliN-T。胶毒素检测结果发现:在野生型T23的24h培养液中未产生胶毒素,而在48、72、96h的培养液中均检测到胶毒素;在相同的条件下,ΔgliN-T在4个生长时期均无法产生胶毒素,表明gliN-T的缺失抑制了绿木霉菌T23胶毒素的合成,说明该基因在胶毒素合成途径中扮演着重要角色。     

甘蓝脂质转运蛋白基因BoLTP的克隆与表达分析

[目的]克隆甘蓝脂质转运蛋白基因(BoLTP)的cDNA及DNA片段,为进一步研究其生物学功能奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中脂质转运蛋白基因的信息,克隆甘蓝不同组织BoL TP基因,对其核酸序列及预测蛋白进行生物信息学分析;检测甘蓝多种组织中BoLTP的表达情况.[结果]克隆获得甘蓝BoL TP的cDNA序列为720 bp,无内含子,编码102个氨基酸.生物信息学分析发现,甘蓝BoLTP具有脂质转运蛋白家族共有特征,具有显著的疏水区,并存在信号肽结构域、AAI结构域.RT-PCR检测结果表明,BoL TP主要在甘蓝雄蕊中表达,在雌蕊、萼片、花瓣、花茎及叶片中均无表达.[结论]甘蓝BoLTP基因可能与甘蓝雄蕊中花粉的发育相关.     

低氮胁迫下香蕉硝酸盐转运蛋白MaNRT2基因的克隆与表达分析

氮素是植物生长发育所必需的大量元素,也是限制植物产量的首要因素,硝酸盐转运蛋白NRT是植物吸收和利用氮素的重要蛋白。笔者以香蕉为实验材料,通过RNA-Seq测序,筛选得到一个显著差异表达的高亲和硝酸盐转运蛋白基因NRT2;通过PCR克隆获得1 509 bp的c DNA序列,生物信息学预测其编码502氨基酸,含有MFS结构域,属于NRT2基因家族,命名为MaNRT2;RNA-Seq和qRT-PCR的结果显示,MaNRT2基因的表达具有显著的组织特异性,在根中远高于叶片;低氮胁迫处理后,MaNRT2在叶片中表达量上升,在根中表达量反而下降,表明MaNRT2与香蕉氮元素的吸收转运密切相关。     

粘绿木霉Gv29-8的碳水化合物活性酶类蛋白预测及遗传关系分析

利用CAT(CAZymes analysis toolkit)在线分析程序对Trichoderma virens Gv29-8中碳水化合物活性酶类蛋白(carbohydrate-active enzymes,CAZymes)不同亚家族的分布情况进行分析,结果表明:粘绿木霉Gv29-8中含有185个CAZymes蛋白,分为主要类别和复合类别两种类型;其中,主要类别含有71个GH蛋白、54个CBM蛋白及12个AA蛋白、25个CE蛋白、3个PL蛋白、3个GT蛋白;复合类型含有17个蛋白。遗传关系分析表明,CAZymes分类应进一步细化到更小的类别。     

氟苯尼考对三疣梭子蟹不同组织中ABC转运蛋白基因(ABCG)表达量的影响

为研究氟苯尼考(FLR)对三疣梭子蟹Portunus trituberculatus不同组织中ABC转运蛋白基因(ABCG)表达量的影响,采用RACE法进行了三疣梭子蟹ABCG基因克隆并对其生物学进行了分析,采用荧光定量PCR法进行了不同浓度(20、40、80 mg/kg)氟苯尼考对三疣梭子蟹肝胰腺、鳃和肌肉中ABCG相对表达量的影响研究。结果表明:三疣梭子蟹ABCG基因全长c DNA序列为2473 bp,共编码578个氨基酸;三疣梭子蟹ABCG不含信号肽,具ABC转运家族蛋白的典型结构域,包括1个高度保守的核苷酸结构域(NBD)和1个疏水性跨膜区(TMD),为半转运子;同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹ABCG与中国对虾、凡纳滨对虾的ABCG聚为一支,具有较高的亲缘关系;不同浓度的氟苯尼考对三疣梭子蟹肝胰腺、鳃、肌肉中ABCG表达均具有诱导作用,且呈时间剂量效应,由此推测,三疣梭子蟹ABCG蛋白参与氟苯尼考的代谢转运过程。本研究结果可为揭示甲壳动物ABCG转运蛋白对抗生素的转运机制提供参考依据。     

绿色木霉菌T23对微量元素吸收利用的初步研究

利用原子吸收光谱和常规生长量测定法,研究了木霉菌T23对7种微量元素Mn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mo6+的吸收利用及7种微量元素对木霉菌T23生长的影响。结果表明:木霉菌T23对7种微量元素的吸收率存在明显差异,能够大量吸收Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mn2+和Fe2+,基本不吸收Mo6+元素。在微量元素对木霉菌T23生长的影响方面,则表现为Ca2+、Mn2+、Zn2+可不同程度地促进木霉菌T23产孢,Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+在组合培养基中促进木霉菌T23菌丝生长,Mo6+抑制木霉菌T23的菌丝生长和产孢。     

Quantification of the expression of chitinolytic enzyme encoding genes ech30, ech42 and nag1 in Trichoderma atroviride P1 under varying growth conditions using a real-time RT-PCR assay

The quantitative expression and the regulation of chitinase-encoding genes ech30, ech42 and nag1 in Trichoderma atroviride P1 under varying growth conditions were investigated using real-time RT-PCR, principle component and multivariate analyses. Twelve media combinations including 0.1% and 3% glucose as carbon source and no (0 mmol/L), low (10 mmol/L) and high (100 mmol/L) ammonium acetate as nitrogen source combined with or without colloidal chitin at 3 time intervals and 2 replicat…     

哈茨木霉T2菌株提取物对齐整小核菌抑菌活性的测定

采用甲醇法、乙醇法、超声波水法、碱法等4种方法对哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)T2菌株分生孢子中的抗菌物质进行了提取,并测定了各种粗提物对齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的抑菌活性及温度对粗提物抑菌活性的影响.结果表明,用不同方法提取的哈茨木霉T2菌株粗提物对齐整小核菌有不同程度的抑制效果,其中以超声波水法提取物对齐整小核菌的抑制效果较好,温度对粗提物的抑菌活性有明显的影响.     

康宁木霉T_2菌株防治根结线虫的应用方法研究

[目的]为解除土壤抑菌作用,提高康宁木霉T2菌株防治根结线虫效果。[方法]室内试验分别测定T2菌株对根结线虫卵的寄生能力,T2菌种发酵液的杀根结线虫幼虫活性,T2菌株分解秸秆及其在土壤中的定殖能力;并通过盆栽试验测定不同土壤处理对番茄根结线虫病害的防治效果。[结果]T2菌株对根结线虫卵的寄生能力强,其代谢物有一定的杀根结线虫幼虫活性;T2菌株能快速降解秸秆,土壤碳氮源对秸秆降解有很大的影响;在添加秸秆粉和乳酸后,T2菌株在土壤中的定殖能力较强。盆栽试验结果表明,在有秸秆粉及乳酸存在的条件下,T2菌株防治番茄根结线虫病害效果达76.4%。[结论]康宁木霉T2菌株与草粉和乳酸联合使用防治根结线虫效果显著,具有一定的田间应用前景。     

哈茨木霉T_2菌株耐药性的测定及其对几种病原菌的抑制作用研究

[目的]为提高木霉菌的生物防治效果。[方法]研究了哈茨木霉T2菌株对3种病原真菌(齐整小核菌、立枯丝核菌和香蕉枯萎病菌)的抑制作用,分析其对7种杀菌剂的耐药性,并探讨了哈茨木霉T2菌株与杀菌剂联用对立枯丝核菌和齐整小核菌的抑制作用。[结果]哈茨木霉T2菌株对病原真菌的抑制随处理时间的延长而增强。处理后120 h其对齐整小核菌、立枯丝核菌、香蕉枯萎病菌的抑制率最高,分别为63.10%、65.64%和33.84%。哈茨木霉T2菌株对多菌灵的耐药性最强,EC50为4 345.32 mg/L。在浓度为800 mg/L时多菌灵对哈茨木霉T2菌株的抑制率为13.73%,当浓度在50 mg/L以下时抑菌率几乎为0。哈茨木霉T2菌株对代森锰锌、露星较敏感。[结论]哈茨木霉T2菌株与甲霜灵联用,能明显抑制齐整小核菌、立枯丝核菌的生长。     

哈茨木霉T2-16代谢产物诱导豇豆幼苗抗枯萎病研究

为探明木霉代谢产物对植物病害的拮抗机制,用哈茨木霉T2-16菌株发酵代谢产物对豇豆种子进行了浸种处理,并在温室条件下于幼苗期注射法接种枯萎病菌,结果表明,该代谢产物可诱导豇豆幼苗产生对枯萎病的获得抗性.其叶片中的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性均增强,并在某一时段显著高于未经木霉代谢产物浸种的对照,枯萎病发病率也极显著低于对照,对该病的防效可达73.6%.     

茶尺蠖信息素结合蛋白PBP2的基因克隆、原核表达及其结合功能

【目的】茶尺蠖(Ectropis obliqua)是中国茶区主要的鳞翅目害虫,其幼虫暴食性常给茶园带来巨大损失。鳞翅目昆虫雌雄个体间普遍存在着性信息素通讯环节,而茶尺蠖性信息素识别途径一直鲜有报道。论文旨在通过对茶尺蠖性信息素识别过程中的结合蛋白基因进行鉴定和功能研究,为茶尺蠖性信息素化学通讯和嗅觉信息识别传递机制提供理论依据。【方法】利用RT-PCR技术对从雄虫触角转录组数据中首次鉴定和发现的一个茶尺蠖信息素结合蛋白基因(pheromone-binding protein,PBP)2(EoblPBP2)进行全长cDNA序列克隆(Gen Bank登录号为KX421383)后,将该基因与pET32a载体连接构建表达载体。随后向导入pET32a/EoblPBP2表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)中对其表达载体加入终浓度1 mmol·L~(-1)的IPTG进行蛋白的诱导表达,进一步利用镍NTA琼脂糖凝胶柱和含有咪唑的上清缓冲液分离目的蛋白,以PBS缓冲液作为透析液纯化得到高浓度重组蛋白。最后通过荧光竞争法,利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光报告子以放大荧光信号,随后向重组蛋白与1-NPN混合体系中分别加入(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯以及10种测试气味后经过分子荧光光度计扫描得到相对荧光值,计算各配基的解离常数KD,研究重组蛋白与茶尺蠖性信息素和茶树挥发物的生理功能。【结果】EoblPBP2全长为492 bp,编码了163个氨基酸,蛋白相对分子质量为15.9kD,等电点为4.983,具有保守的6个半胱氨酸,根据分子进化树分析其应归属于昆虫PBPs家族。结合功能结果显示,10种测试气味均能将1-NPN与茶尺蠖EoblPBP2重组蛋白的混合体系于420 nm处的相对荧光值降至50%以下。其中β-紫罗兰酮、邻苯二甲酸二丁酯、苯乙醛、癸醛和反-2-癸烯醛等5种茶树挥发物质与EoblPBP2重组蛋白的结合能力较强,解离常数KD分别为7.923、14.830、30.368、28.068和27.597μmol·L~(-1)。而性信息素成分之一的(Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯与EoblPBP2的解离常数KD仅为172.591μmol·L~(-1),仅小于苯甲醇的解离常数KD 230.880μmol·L~(-1),而远远大于上述5种气味物质。表明EoblPBP2重组蛋白具有茶尺蠖性信息素成分((Z,Z,Z)-3,6,9-十八碳三烯)和植物挥发物质广谱结合能力,而其与性信息素的亲和力弱于大部分测试植物挥发物。【结论】EoblPBP2能与包括性信息素成分在内的多种植物挥发物结合,可能是一种具备特殊复合功能的信息素结合蛋白,可用之进一步研究茶尺蠖的性信息素识别和传递途径。     

‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因DkGAI2的克隆与功能分析

【目的】 对DkGAI2的亚细胞定位及表达特性进行分析,并将DkGAI2转化烟草,分析转基因烟草的生理和形态指标,为GAI的深入研究提供理论基础。【方法】 以‘南通小方柿’高通量转录组测序结果中标注的GAI2为原始序列（未发表）,利用RT-PCR,3′ RACE和5′ RACE技术从‘南通小方柿’中克隆得到DkGAI2的序列全长。利用生物信息学分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析DkGAI2在‘大方柿’及‘南通小方柿’5个不同物候期的表达特性以及DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中的表达特性,构建瞬时表达载体pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2,并瞬时侵染烟草分析DkGAI2的亚细胞定位,通过构建DkGAI2植物双元表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,经过GUS染色、RT-PCR对转基因烟草株系进行鉴定;并将野生型和转基因烟草移栽,于第一朵花开放时测定转基因植株的株高、节间长度、叶片长宽比以及GA₁和GA₄含量。【结果】 从‘南通小方柿’中克隆得到了1 827 bp的DkGAI2,DkGAI2核苷酸序列与猕猴桃（KF588651.1）、光皮烨（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、苹果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的相似度达72%-80%,DkGAI2具有DELLA蛋白家族特有的DELLA结构域,属于DELLA蛋白基因家族。DkGAI2编码608个氨基酸,相对分子质量为66.5 kD,理论等电点为5.54,不稳定系数为50.41,无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽。序列系统进化分析结果显示,DkGAI2与葡萄亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量都高于‘大方柿’;DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中表现出组织表达特异性,其中,在老叶中表达量最高,其次为茎尖和幼叶,而在幼果中几乎不表达。pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2融合蛋白的绿色荧光信号位于细胞核中,表明DkGAI2编码蛋白位于细胞核。经过GUS染色和RT-PCR检测,共获得5个转DkGAI2烟草株系,转基因烟草叶片GA₁含量增加,GA₄含量降低,GA₁和GA₄总含量降低,且转基因烟草植株出现植株矮化、节间缩短、叶片长宽比降低及花期延迟的表型。【结论】 DkGAI2具有组织表达特异性,定位于细胞核,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量均高于‘大方柿’。推测DkGAI2可能通过降低GA₄的含量进而引起植株矮化。     

新疆棉花主要害虫对几种杀虫剂的抗药性测定

从1992至1998年,分别用毛细管微量点滴法和玻片浸渍法测定了新疆主要棉区的棉铃虫、棉蚜、棉叶螨对杀虫剂的敏感性,结果表明棉铃虫对拟除虫菊酯类药剂基本处于敏感阶段,棉蚜对各种药剂已产生不同程度的抗药性,棉叶螨对有机磷类杀虫剂已产生低至中等水平的抗药性,对杀螨剂仍处于敏感阶段,根据敏感性测定结果和新疆棉花种植特点,对延缓和治理新疆棉花主要害虫抗药性进行了探讨。     

果子狸苦味受体Tas2R2基因的克隆与序列分析

采用PCR和克隆测序方法首次从果子狸基因组中获得一全长为1 037 bp的苦味受体Tas 2R2基因DNA序列.该序列含有完整的1个外显子(无内含子),大小为915 bp,编码304个氨基酸残基.其蛋白质等电点为9.84,分子量为34.87 ku.高级结构预测显示果子狸Tas2R2蛋白由4个胞外区、7个跨膜区和4个胞内区组成,该蛋白上含有N糖基化位点、丝氨酸磷酸化位点、色氨酸磷酸化位点各3个和酪氨酸磷酸化位点1个.亲水性/疏水性分析表明,果子狸Tas2R2蛋白质为疏水性蛋白,其亲水性区段所占比例较小.种间同源性比较显示,果子狸Tas 2R2基因与猫、犬、大熊猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的eDNA序列同源性分别为93.0％、89.4％、89.9％、85.4％、85.9％、84.6％、72.2％;氨基酸序列同源性分别为88.8％、81.1％、83.2％、75.9％、77.8％、75.5％、61.3％.果子狸、猫、犬、大熊猫、牛、马、黑猩猩和小鼠的Tas 2R2基因编码序列构建的进化树表明果子狸与猫的亲缘关系最近.