牛磺酸在牛胚胎体外发育中的作用研究

研究了牛体外受精后早期胚胎体外发育时,向其基础培养液中加入牛磺酸对胚胎桑椹胚率、囊胚率和孵化囊胚率的影响,以探寻牛磺酸克服牛胚胎"体外发育阻滞"现象的作用。试验结果表明:以TCM-199 10?S为基础培养液(对照组),再加入7,14mM的牛磺酸(试验组),试验组与对照组的桑椹胚率分别为48.1%、47.4%和43.2%;囊胚率分别为26.4%、22.3%和21.0%;孵化囊胚率分别为21.8%、18.7%和0%。IVF后2细胞、4～8细胞及8～16细胞期,在基础培养液中分别添加7mM的牛磺酸时,桑椹胚率分别为48.7%、57.1%和52.0%,囊胚率分别为25.1%、30.7%和27.9%,孵化囊胚率分别为25.9%、28.6%和25.0%;而添加14mM牛磺酸组时,桑椹胚率分别为50.4%、56.4%和55.4%,囊胚率分别为26.5%、31.3%和27.7%,孵化囊胚率分别为27.5%、31.1%和29.9%。体外发育培养液中添加7mM牛磺酸可显著提高桑椹胚率和囊胚率(p<0.05),在4～8细胞期添加14mM牛磺酸最为合适。     

HA对牛卵母细胞体外成熟和早期胚胎体外发育影响的研究

在TCM-199中添加一些确定的辅助成分,探讨在无血清培养基中添加不同浓度HA对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外发育的影响。结果表明,在卵母细胞成熟培养液(TCM-199-m)中添加4.0mg/mL的HA时,卵母细胞的成熟率和卵裂率与对照组(BSA)无显著差异(P>0.05),分别为85.14%,83.57%和89.47%,85.24%,但显著高于其他各浓度组(P<0.05),表明HA在卵母细胞无血清成熟培养中可代替BSA。在受精卵体外培养液(TCM-199-c)中添加HA时,囊胚发育率与对照组(BSA)差异不显著(P>0.05),分别为27.64%和26.51%,但显著高于TCM-199-c组(P<0.05),表明HA对牛胚胎体外发育具有明显的促进作用,在无血清培养中可以代替BSA。当在TCM-199-c+HA中添加少量的BSA时,囊胚发育率(31.19%)显著高于其他各组(P<0.05),表明HA欲完全代替BSA还有不完善之处,有待进一步研究。     

牛磺酸对断奶小鼠小肠发育的影响

为研究牛磺酸对断奶小鼠小肠结构和功能的影响,采用单因子设计,48只体重为(12±2)g的昆明小鼠随机分为6组,每组8只,雌雄各半,分为对照组和试验组,对照组饮用普通自来水,试验组在饮水中添加2.5、5.0、10.0、20.0和40.0g/L牛磺酸,试验期31d。观察牛磺酸对小肠和肝脏重量,空肠绒毛形态、细胞凋亡、小肠核酸和蛋白质含量,以及血清指标的影响。结果表明:1)饮水中添加牛磺酸可显著提高小鼠小肠绝对重量和相对重量(P0.05),且呈现二次曲线关系(PQ0.05);可线性提高小肠绝对长度、肝脏绝对重量和相对重量(PL0.05)。2)2.5、5.0和10.0g/L组与对照组相比,显著降低空肠肠腺(肠隐窝)深度(P0.05);回肠Prot/DNA随牛磺酸添加量提高而线性提高(PL0.05)。3)与对照组比较,5.0g/L添加组的细胞凋亡指数显著降低(P0.05),但40g/L添加组有升高的趋势。4)随着牛磺酸添加量的提高,回肠MDA含量有降低的趋势(P=0.07),空肠GSHPx呈现先升高再降低的二次曲线关系(PQ0.05),但不影响血清IGF-I水平。研究结果表明,饮水添加中低浓度的牛磺酸可提高小鼠小肠长度和重量,降低肠隐窝深度,减少细胞凋亡。     

亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟与早期胚胎体外发育的影响

收集屠宰场水牛卵巢卵母细胞,在卵子体外成熟和受精后胚胎体外发育过程中分别添加0(对照组),10,50,100和200μmol·L-1的亚麻酸,探究亚麻酸对水牛卵母细胞核成熟率、受精卵的分裂率和植入前胚胎体外发育的影响。结果显示:在水牛卵母细胞体外成熟液中添加亚麻酸,添加浓度50μmol·L-1组的核成熟率(74.18%)显著高于对照组和其他实验组(P0.05),囊胚率(33.24%)显著高于对照组和10μmol·L-1亚麻酸组(P0.05)。在胚胎培养液中添加50μmol·L-1亚麻酸组的囊胚率(34.52%)显著高于对照组和100μmol·L-1亚麻酸组(P0.05);同时在成熟液和胚胎培养液中添加亚麻酸,添加浓度200μmol·L-1组的分裂率显著高于对照组(P0.05),而各组间的囊胚率和D7囊胚比率均差异不显著。结果表明,单独在水牛卵母细胞体外成熟液和胚胎培养液中添加50μmol·L-1亚麻酸能有效促进水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育。     

不同培养液对昆明小鼠体外受精率及早期胚胎体外发育的影响

在TYH受精液中添加促卵泡素（FSH）和苯甲酸雌二醇（E2）,检测不同浓度的FSH和E2对昆明小鼠的体外受精率的影响;检测在M16、CZB两种培养液中添加胎牛血清（FCS）与否对昆明小鼠早期胚胎体外发育的影响．结果表明：在．rYH中添加1．0IU／mL FSH,受精率和2-细胞胚率显著高于对照组;在TYH中添加0．1μg／mL E2,受精率和2-细胞胚率也显著高于对照组．在CZB中添加体积分数为10％FCS,可显著减少2一细胞期体外发育阻断,并显著提高小鼠胚胎体外发育的囊胚率,可见,以TYH添加1．0IU／mL FSH和0．1μg／mL E2为受精液,以含体积分数为10％FCS的CZB为胚胎培养液,小鼠胚胎可获得较高的囊胚率．葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的．     

GSH和过氧化氢对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究活性氧(ROS)-过氧化氢和抗氧化剂-还原型谷胱甘肽(GSH)对小鼠2-细胞期胚胎体外发育的影响.用含有不同浓度H2O2的mSOF液培养小鼠胚胎,从H2O2浓度0.14 mg/L组开始的囊胚发育率显著低于对照组和其它组(P0.05);以mSOF液为基础液,在添加0.14 mg/L H2O2的基础上分别添加不同浓度的GSH,阳性对照组的囊胚发育率显著高于阴性对照组(P0.05);在添加外源性H2O2(0.14 mg/L)的情况下,随着GSH浓度的增加其囊胚发育率也显著增加.结果表明,H2O2可诱导小鼠2-细胞期胚胎体外发育的阻滞,GSH可阻止H2O2对小鼠2-细胞期胚胎的抑制效果.     

Aroclor 1254对小鼠早期胚胎体外发育的影响

【目的】探讨了Aroclor 1254对小鼠2-细胞和8-细胞胚胎体外发育的影响。【方法】在体外培养的小鼠2-细胞和8-细胞胚胎培养液中,分别添加质量浓度为0.05,0.25,1.25和6.25μg/mL的Aroclor 1254,并设Aro-clor 1254溶剂(乙醇)对照组和空白对照组,比较不同质量浓度的Aroclor 1254对小鼠2-细胞和8-细胞胚胎体外发育的影响。【结果】0.05μg/mL Aroclor 1254影响2-细胞胚胎的孵化(57.7%),与溶剂对照组(66.7%)差异显著(P<0.05);0.25μg/mL Aroclor 1254组,2-细胞胚胎的囊胚发育率(72.5%)及囊胚孵化率(23.2%)与溶剂对照组(84.2%,66.7%)差异极显著(P<0.01);1.25μg/mL Aroclor 1254组,2-细胞胚胎发育到8-细胞阶段的比率(32.1%)极显著低于溶剂对照组(P<0.01);6.25μg/mL Aroclor 1254组,2-细胞胚胎发育到4-细胞和8-细胞阶段的比率(58.1%和29.6%)极显著低于溶剂对照组(P<0.01)。0.05μg/mL Aroclor 1254对8-细胞胚胎发育无明显影响;但当质量浓度提高到0.25μg/mL时,Arolor 1254显著影响8-细胞胚胎的孵化(64.7%,P<0.05);1.25μg/mLAroclor 1254组,8-细胞胚胎囊胚发育率(68.6%)及孵化率(25.5%)极显著低于溶剂对照组(92.4%,75.7%)(P<0.01);6.25μg/mL Aroclor 1254组8-细胞胚胎不能继续发育。【结论】Aroclor 1254对小鼠胚胎体外发育存在明显的剂量-毒性关系,随着培养液中Aroclor 1254质量浓度的增加,对小鼠早期胚胎的发育毒性表现越早;胚龄越小,毒性敏感性越强。     

热应激小鼠胚胎着床模型的建立

模拟夏季高温环境对孕鼠的应激作用,建立热应激影响昆明白小鼠胚胎着床的模型。试验设为对照组(23℃±2℃)、40℃和42℃应激组(小鼠妊娠1～4d,分别应激2h),比较观察妊娠5、6、7d小鼠胚胎着床数及子宫状况和产仔数。结果表明,与对照组相比40℃和42℃应激组妊娠5d(11.00±2.65、10.00±2.12vs15.00±1.58,P0.05)、6d(11.40±3.21、10.60±2.30vs 15.00±0.71,P0.05)、7d(11.00±2.55、11.00±1.58vs 15.60±1.67,P0.05)胚胎着床率显著下降,产仔数(8.60±1.14、8.40±1.82vs 11.40±1.82,P0.05)也显著下降;且相比对照组其着床位点均较少且分布失衡。40℃和42℃应激组之间无显著差异,以42℃应激组影响相对较大。可见,胚胎着床前孕鼠连续4d40℃、42℃应激2h,可显著影响小鼠的繁殖能力。42℃可作为影响小鼠胚胎着床的热应激模型。     

不同交配时间对小鼠胚胎收集和发育的影响

【目的】探索不同交配时间对小鼠胚胎收集和胚胎发育的影响,为小鼠的超排研究提供参考。【方法】对小鼠进行超数排卵,分别于注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）后9,10,11,12,13,14和15 h,在输卵管膨大部收集卵母细胞,研究排卵情况;将超排雌鼠与雄鼠合笼,分别于合笼后2,4,6,8,10和12 h观察小鼠是否见阴道栓,研究小鼠交配时间;为了控制小鼠的交配时间,将超排雌鼠分别于注射hCG后0,2,4,6,8,10,12,14,16和18 h与雄鼠合笼,每个时间点合笼后2 h观察交配情况,于注射hCG后98 h从子宫角收集囊胚,统计胚胎收集率,观察胚胎发育情况。【结果】小鼠排卵主要集中于注射hCG后12～14 h,交配时间主要在注射hCG后的前6 h。人为控制交配时间发现,注射hCG后4,6,8,10和12 h的交配率均较高,较高的胚胎收集率出现在注射hCG后8,10和12 h;囊胚发育率在注射hCG后4 h （56.0%）和8 h（54.5%）较高;扩张囊胚发育率在注射hCG后12 h （68.2%）和16 h （58.0%）显著高于其他时间点（P<0.05）。【结论】交配时间影响小鼠交配成功率、胚胎收集率和胚胎发育;超数排卵后12 h交配可提高小鼠的胚胎收集率和胚胎发育率。     

猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究了不同生殖时期猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响,以此建立了适于早期小鼠转基因胚胎体外培养的猪输卵管上皮细胞共培养体系,并用PCR法对体外培养发育到不同阶段的小鼠转基因胚胎进行了外源基因整合检测。结果表明,在受孕初期的猪输卵管上皮细胞(无论是原代还是传代细胞)上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率显著高于发情间期的猪输卵管上皮细胞(P<0.01);在相同生殖时期猪输卵管原代和传代上皮细胞上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率差异不显著;在转基因胚胎不同发育阶段,PCR检测呈阳性的胚胎比率分别为:2-细胞期为96%,4-细胞期为63%,8-细胞期为43%,囊胚期为19%。由此可见,受孕初期的猪输卵管上皮细胞可促进与之体外共培养的小鼠早期胚胎的发育;随着早期小鼠转基因胚胎的发育,PCR检测呈阳性的转基因胚胎的比率逐渐降低。     

胚胎移植时机对牛体细胞克隆胚胎妊娠率的影响

以活体取卵OUP来源的牛卵母细胞为受体胞质,以Holstein奶牛的牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞克隆．并将发育7d的克隆囊胚和体内胚分别及体外胚进行移植,观察移植时机对受孕率的影响。依据代孕牛排卵后天数的不同分为3个实验组,组1：排卵后5-6d（不含6d）;组2：排卵后6—7d;组3：排卵后7～8d（不含7d）。结果显示：对于体外胚胎而言,第2组的受孕率高于第1组（P〉0．05）,第3组的受孕率最低（Pt0．05）,且120d的受孕率为0。与此相反,对于体内胚胎。第3组的受孕率高于其他2组。通过实验可以证明对于7d的体外胚胎选择在代孕牛排卵后6—7d移植可以得到较高的受孕率：而对于体内胚胎而言则应选择在受体牛排卵后7—8d移植,可得到较高的妊娠率。     

蒙古绵羊早期胚胎的消化及呼吸器官的发生

蒙古绵羊胚胎的原肠、消化及呼吸器官,内分泌腺的原基,发生在交配后的8～30d。胚胎发育到20～21d,胚长4～6mm;到22～23d,胚长7～9mm;到24～30d,胚长10～15mm。交配后8d12h,胚胎原肠呈球形,16d14h,原肠发育成管状,分前肠、中肠及后肠。胚长4～14mm,头侧5对鳃弓逐渐退化,口膜破裂与前肠相通,上下颌及舌已形成。感官及主要内分泌腺的原基也已发生。食道呈管状,胃芽由棱形变成椭圆形。分化出三室,背系膜中有脾芽发生。胚长4～5mm 时,前中后肠呈直管状,到6～9mm,肠襻似“V”字形;胚长10～15mm 时,“V”形肠襻以背系膜为中轴,顺时针旋转180°。胚胎发育到20d,前肠腹面的内胚层发生出1个肝憩室,到22d,肝芽内细胞索交织成网,其中形成静脉导管。到交配后30d,总胆管通向降肠起端。背胰芽发生于前肠背面的内胚层,腹胰芽发生于胆囊管后方的前肠腹面,腹胰芽从前肠右侧伸向背胰芽,合并为胰腺原基。从4mm 长胚胎开始,咽底面发生喉气管沟,进而形成喉气管芽,到胚长15mm,气管芽依次分支形成肺芽原基。     

亚硒酸钠对小鼠附植前胚胎发育能力的影响

为探讨不同浓度的亚硒酸钠对小鼠体重、超排效果及其胚胎后续发育的影响,将6～7周龄的小鼠随机分为4组,1组为对照组,其余3组按小鼠每千克体重分别注射0.30 mg(低剂量组)、1.50 mg(中剂量组)和2.25 mg(高剂量组)的亚硒酸钠溶液,再分别测量各组小鼠的体重及观察、记录各组小鼠的超排效果和胚胎体外发育情况.结果显示:(1)高剂量组小鼠体重变化量(-0.31 g)显著低于低剂量组(7.95 g)、中剂量组(8.65 g)和对照组(11.06 g)(P＜0.05),而低剂量组、中剂量组与对照组之间无显著差异(P＞0.05);(2)不同剂量亚硒酸钠处理的小鼠经超排后回收的平均可用胚胎数,各组之间相比均无显著差异(P＞0.05),但高剂量组冲出的胚胎经体外培养后的囊胚发育率(17.6％)显著低于对照组(27.6％)(P＜0.05),而与低剂量组(24.3％)和中剂量组(20.6％)差异不显著(P＞0.05).以上结果表明,高剂量的亚硒酸钠不利于小鼠胚胎的发育,其作用机制需要从细胞和分子水平做更深入的研究.     

A Novel Three-Dimensional Mouse Embryonic Implantation Model In Vitro

To regenerate three-dimensional endometrium in vitro as a novel model for studying the mechanism of implantation of embryos, the luminal epithelial cells and stromal cells of the rabbit uterus were separated and cultured in vitro. The type Ⅰ mouse tail collagen was used as scaffolding material. The stromal cells were inoculated in the type I mouse tail collagen, and the luminal epithelial cells were inoculated on the type i mouse tall collagen to regenerate the endometrium in vitro. The regenerated endometrium was cultured in DMEM-F/12 media containing 100 nmol L^-1 progesterone, 10 nM β-estradiol, and 10% fetal bovine serum （FBS） for 3 d. The media were then replaced with CZB containing 100 nM progesterone, 10 nmol L-1 β-estradiol, and 10% FBS, and the mouse blastulas were co-cultured with it. The results of scanning electronic micrography showed that the epithelial cells on the surface of the reconstructed endometrium were covered with numerous slender microvilli and some epithelial cells protruded pinopodes. After culturing for 12 h with the mouse blastula, the shedding, attachment, and implantation of the blastula were observed. The blastula can escape from zona pellucida and attach to the three-dimensional endometrium and is then implanted into it. This study showed that the reconstructed three-dimensional endometrium can serve as a robust embryo implantation model in vitro.     

小鼠冻胚分割试验

研究了分割所用溶液、冷冻前胚胎发育时期和分割后将半胚是否装入透明带对冻胚分割效果的影响。结果证明:①将解冻囊胚分割后,无论是否将半胚装入透明带对冻胚分割的效果均无显著影响(P>0.05);②在PBS中分割解冻桑椹胚和囊胚的效果无显著差异(P>0.05);③与分割解冻桑椹胚相比,在蔗糖液中分割解冻囊胚可显著提高冻胚分割效果(P<0.05)。将在蔗糖液中分割冻囊胚获得10对半胚移植于5只受体,结果有2只妊娠,共获得半胚仔鼠6只,其中2对为同卵双生。     

化学培养液对小鼠原核胚体外发育的影响

本试验用０．１ｍＬ培养液在３７℃，５％ＣＯ２条件下培养昆明小鼠原核胚。结果表明，用ｍＳＯＦ和ＰＬ３培养小鼠原核胚，４－细胞发育率分别为１０％和７７％。以后停止发育；ＰＬ３和ＰＬ３培养小鼠原核胚，每２４ｈ换１次培养液，结果发育到桑椹胚和囊胚的百分离分别是２７．５％和３８．５％；用ｍＭＴＦ，ｍＭＴＦ＋２０ＡＡ，ｍＭＴＦ＋Ｎｏｎ＋Ｇｌｎ，ｍＭＴＦ＋Ｎｏｎ，ｍＭＴＦ＋Ｅｓｓ＋Ｇｌｎ培养小鼠原核胚，发育率分     

不同发育时期鼠胚对一步细管内冷冻一解冻耐受性的研究

本试验采用一步添加防冻剂（１０％甘油）、１２．５％蔗糖一步细管内脱除甘油，３７℃温水快速解冻法，对３９３枚处于不同发育时期的优良胚胎做了冷冻研究，旨在探索不同发育时期的胚胎对一步细管内冷冻解冻耐受性存在的差异，为哺乳动物胚胎冷冻和移植提供资料。解冻后体外培养结果表明，晚期桑椹胚（包括致密桑椹胚和致密后桑椹胚两个阶段）的抗冻能力最强，体外发育率致密桑椹胚为８０．０％（３２／４０）、致密后桑椹胚为７８．０％（３２／４１）；早期桑椹胚和早期囊胚次之，体外发育率为６２．２％（２８／４５）和６６．１％（３９／５９）；囊胚和扩展囊胚的抗冻能力最低，体外发育率仅为５１．６％（３１／６０）和５４．５％（１８／３３）。     

昆明小鼠早期胚胎PFK基因转录产物的检测

根据小鼠肝脏型6－磷酸果糖激酶（PFK）的cDNA序列设计合成内外2对引物，以巢式RT－PCR方法检测昆明小鼠早期胚胎是否转录出PFK的mRNA。结果表明，1－细胞至桑椹期胚的mRNA均能以外引物扩增产物为模板 通过内引物扩增出1和特异目的片段，表明昆明小鼠1－、2－、4－、8－细胞至桑椹期胚胎的PFK以肝脏型的形式出现，其PFK基因已转录，糖酵解及三羧酸循环可能是早期胚胎葡萄糖代谢的主要方式。