补阳还五汤超微饮片对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后Bcl-2、Bax表达的影响

目的 探讨补阳还五汤超微饮片对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后凋亡相关基因Bcl-2、Bax的影响。方法 将SD大鼠80只,雌雄各半,复制局灶性脑缺血大鼠模型,造模后按神经功能缺损评分进行分层,随机分为5组,每组15只,分别于移植后7 d、14 d、28 d进行神经功能评分,采用补阳还五汤超微饮片与传统饮片予以干预,于相应时间点处死大鼠后采用免疫组化法检测凋亡基因Bcl-2、Bax。结果 补阳还五汤能显著减轻神经功能缺损,Bcl-2、Bax在各时间点（7 d、14 d、28 d）表达与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）,模型加移植加补阳还五汤超微饮片组上调Bcl-2、拮抗Bax表达的作用优于模型加移植加补阳还五汤传统饮片组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 补阳还五汤可调节脑缺血后Bcl-2、Bax的表达,是其促进神经功能恢复的可能机制之一,且超微饮片组的作用较传统饮片组更加显著。     

中药补阳还五汤的HPLC指纹图谱研究

采用高效液相色谱法建立了中药复方补阳还五汤的指纹图谱分析方法.实验采用Krosmasil C18色谱柱(250×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈-水,梯度洗脱;检测波长为220 nm,流速1.0 mL/min.以芍药苷为参照峰,标示出补阳还五汤的13个共有峰.结果表明:该方法操作简单,精密度和稳定性良好,可为补阳还五汤的质量控制提供更全面的信息.

Abstract：

The HPLC method was established to determine the fingerprint of the Chinese traditional medicine Buyanghuanwu decoction. Chromatographic conditions included Krosmasil C18 column (250 × 4.6mm, 5 μm) and the mobile phase composed of a mixture of acetonitrile-water(gradient elution), detection wavelength at 220 nm. The mobile phase flow rate was 1.0 mL/min. Thirteen peaks were observed on the HPLC fingerprint of Buyanghuanwu decoction. The results showed that the method was reliable and could be helpful for the quality control of Buyanghuanwu decoction.     

对INT-FAK信号通路调控脑缺血后神经细胞凋亡的思考

脑缺血性疾病是人类健康的主要杀手之一,相关研究表明,神经细胞的凋亡是造成脑缺血疾病中神经系统损害的主要机制之一,而以整合素-黏着斑激酶（INT-FAK）控制调节的PI3K/PDK/Akt以及Raf/MEK/ERK两条主要信号途径引起的细胞凋亡是其主要作用机制。凋亡过程出现的诸多能加以调控的信号分子,都可以作为治疗脑缺血性损伤的潜在靶点。随着对脑缺血损伤与神经细胞凋亡关联的深入研究,抗凋亡治疗已经成为治疗脑缺血性疾病的重要途径。     

补阳还五汤及其四类有效部位对脊髓损伤大鼠大脑运动皮质的神经保护作用

目的 观察补阳还五汤（BYHWD）及其四类有效部位（生物碱、苷、多糖、苷元）对脊髓损伤（SCI）大鼠大脑运动皮质神经元的影响,探究其神经保护作用的可能机制。方法 SD雄性大鼠48只,随机分为8组：正常组、假手术组、SCI组、BYHWD组、生物碱组、苷组、多糖组、苷元组。通过在T₃-T₄之间横断右侧半脊髓制备SCI模型,分别于术前1 d及术后1 d、1 w、4 w、8 w运用BBB评分评定大鼠后肢运动功能;术后8 w用TUNEL法检测神经细胞凋亡。结果 SCI组与药物干预各组BBB评分均明显低于同期正常组、假手术组（P<0.01）;术后4 w,BYHWD组和生物碱组大鼠的BBB评分高于SCI组（P<0.05）;术后8w,BYHWD组、生物碱组和苷组大鼠的BBB评分高于SCI组（P<0.05）。术后8 w, SCI组及药物干预各组大鼠细胞凋亡率明显高于正常组和假手术组（P<0.01）。BYHWD组、生物碱组和苷组大鼠的细胞凋亡率低于SCI组（P<0.01或P<0.05）;生物碱组、苷组、多糖组、苷元组的细胞凋亡率高于BYHWD组（P<0.01或P<0.05）。结论 BYHWD具有改善SCI大鼠后肢运动作用,其有效部位中的生物碱、苷可能为起效的主要物质基础,该作用机制可能与拮抗SCI大鼠运动皮质神经元凋亡有关。     

基于PCA-GRA的补阳还五汤及其精简方抗脑缺血损伤功效的谱效关系研究

采用高效液相色谱法获取12批补阳还五汤全方、14批补阳还五汤精简方指纹图谱化学成分的数据,运用主成分分析法（principal component analysis,PCA）对采集的数据进行降维处理,计算出综合排名第一的中药材指纹图谱批次。运用灰色关联度法（grey relational analysis,GRA）将所求批次的指纹图谱特征峰和脑损伤的保护作用关联起来,探讨补阳还五汤全方及精简方中指纹图谱共有峰和特有峰与脑损伤保护作用贡献程度的强弱关系。本研究结合PCA和GRA开展补阳还五汤谱效关系研究,能提升数据的有效性和准确度。     

左归丸对去势大鼠钙转运通路相关蛋白的影响

目的 探讨左归丸去势大鼠骨密度和骨、肾组织中钙转运通路相关蛋白的影响。方法 选取48只雌性SD大鼠,随机分为正常组,假手术组,模型组,西药组,中药低、高剂量组。除假手术组和正常组,其余组切除大鼠卵巢,造模成功后3个月进行各组干预。3个月后处死大鼠,检测大鼠骨密度（BMD）;Western blotting法检测钙转运通路（肾组织）蛋白表达;免疫组化检测去势大鼠骨组织中新型上皮钙通道5（TRPV5）蛋白的表达。结果 与模型组相比,左归丸高剂量组与西药组大鼠骨密度均有改善（P<0.05）;与假手术组比较,模型组各蛋白表达均有不同程度下降（P<0.01,P<0.05）;尼尔雌醇和左归丸均能不同程度上调去势大鼠肾组织中TRPV5蛋白、钠钙交换器（NCX1）蛋白、钙结合蛋白-D28K（CaBP-D28K）和细胞膜钙汞（PMCA1b）蛋白表达,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;免疫组化显示模型组较假手术组的TRPV5蛋白表达率增加（P<0.05）,而西药组和中药高、低剂量组较模型组蛋白表达率均下降（P<0.05）。结论 左归丸可通过上调肾钙转运通路中相关蛋白的表达和降低大鼠破骨细胞中TRPV5蛋白的表达,而发挥骨质疏松症治疗作用,肾、骨组织中钙转运过程相关蛋白可能成为骨质疏松症治疗的新方向、新靶点。     

补阳还五汤联合BMSCs移植对脊髓损伤气虚血瘀证红核神经元的影响

目的 探讨补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction,BYHWD）联合骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）移植对保护脊髓损伤（sipnal cord injury,SCI）气虚血瘀证红核神经元是否能产生协同增效作用。方法 将30只雄性SD大鼠随机分为5组：正常组、气虚血瘀组、BYHWD组、BMSCs组、BYHWD+BMSCs组,每组6只。采用游泳力竭法联合红核脊髓束（rubrospinal tract,RST）横断手术制备气虚血瘀证大鼠模型,并予以相应干预。通过斜板实验观察运动功能恢复情况,尼氏染色观察红核神经元胞体形态及数量,在RST横断点上方注射荧光金（FG）进行神经束路示踪,观察红核神经元胞体形态及数量。结果 术后14 d、28 d,BYHWD+BMSCs组斜板实验评分高于气虚血瘀组、BYHWD组及BMSCs组（P<0.05或P<0.01）。尼氏染色显示与正常组相比,气虚血瘀组尼氏体体积及数量减少,胞浆染色较浅;BYHWD组、BYHWD+BMSCs组的情况优于气虚血瘀组,尤其是BYHWD+BMSCs组。FG逆行示踪显示气虚血瘀组胞体荧光强度减弱、形态不规则、边缘模糊不清,且红核正常神经元数目较正常组明显减少（P<0.01）,BYHWD组、BMSCs组、BYHWD+BMSCs组较模型组增加（P<0.01）,特别是BYHWD+BMSCs组（P<0.01）。结论 BYHWD联合BMSCs移植对保护SCI气虚血瘀证逆行性溃变的红核神经元能产生协同增效作用。     

补阳还五汤提取过程中最佳提取时间和药材粉碎度的研究

目的 研究补阳还五汤提取过程中的最佳提取时间和药材粉碎度。方法 显微观察不同粉碎度的补阳还五汤单味药材,观察药材的破壁情况,采用HPLC分析补阳还五汤不同粉碎度药材的成分溶出情况。结果 显微观察从80目到100目,药材细胞结构已经不完整,细胞壁开始破壁。提取过程的中段,不同粉碎度之间的有效成分共有峰的个数较多,溶出比较完全。在提取时间约300 min时,不同目数指纹图谱的相似度在0.85以上。结论 20目药材在240 min时、40目药材在180 min时、60目在120 min时、80目药材在90 min时、100目药材在30 min时、饮片在180 min时补阳还五汤的溶出达到基本稳定,提取效果最佳。     

解毒化瘀方对凝血酶合并缺氧诱导PC12细胞损伤ERK1/2信号通路表达的影响

目的 探讨急性缺血性中风（AIS）瘀毒病机的分子机制及解毒化瘀方对凝血酶合并缺氧损伤的保护作用。方法 （1）用凝血酶合并缺氧损伤PC12细胞,模拟急性缺血性中风的体外细胞模型。（2）将细胞分为空白组,模型组,解毒化瘀方含药血浆组和PD98059组（MEK抑制剂组）,应用荧光定量实时RT-PCR方法检测MEK1、PAR-1及ERK1/2的mRNA表达,应用免疫荧光法检测ERK1/2、P-ERK1/2的蛋白表达。结果 PCR结果提示：模型组MEK1、PAR-1及ERK1/2的mRNA表达与空白对照组相比显著升高（P<0.01）,解毒化瘀方组和PD98059组MEK1、PAR-1及ERK1/2的mRNA表达较模型组显著降低（P<0.01）,免疫荧光结果提示：解毒化瘀方组和PD98059组ERK1/2、P-ERK1/2的蛋白表达较模型组显著降低（P<0.01）。结论 解毒化瘀方以凝血酶为作用的分子靶点,能够显著降低ERK1/2信号通路在缺血性中风体外细胞模型中的表达。     

补阳还五汤防治急性缺血性脑卒中早期神经功能恶化的临床研究

目的 研究补阳还五汤防治急性缺血性脑卒中早期神经功能恶化的疗效。方法 选取本院2012年3月至2016年8月急性缺血性脑卒中患者60例,按照入院顺序编号,采取随机数字表法将患者分为观察组与对照组,每组30例,给予对照组患者常规西药治疗,观察组患者在对照组治疗基础上联合补阳还五汤治疗,比较两组患者临床治疗有效率,比较治疗前后血液流变学指标、血同型半胱氨酸（Hcy）、C反应蛋白（CRP）、D-二聚体水平以及美国国立卫生院神经功能缺损评分（NIHSS）、日常生活活动能力（Barthel）评分变化情况。结果 观察组临床治疗总有效率为86.67%,显著高于对照组63.33%（P<0.05）;治疗后,观察组血小板聚集率、纤维蛋白原水平、全血粘度、血浆粘度较对照组显著降低（P<0.05）;观察组Hcy、CRP、D-二聚体水平较对照组显著降低（P<0.05）;观察组NIHSS评分较对照组显著降低（P<0.05）,Barthel评分较对照组显著升高（P<0.05）。结论 补阳还五汤联合西药防治缺血性脑卒中早期神经功能恶化疗效确切,能通过改善患者血液流变学指标水平降低血脂、降低炎性水平达到提高脑神经功能水平的目的,值得临床推广应用。     

丹参通络解毒汤联合骨髓干细胞动员对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮的保护作用

目的 通过观察心肌缺血再灌注损伤大鼠NO水平、eNOS蛋白和eNOS mRNA表达,探讨丹参通络解毒汤联合骨髓干细胞动员对心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮保护作用。方法 大鼠60只,随机分为假手术组、模型组、重组人红细胞生成素（recombinant human erthropoietin,rhEPO）动员组、丹参通络解毒汤组;丹参通络解毒汤联合动员组,每组12只。于造模后14 d采用放射免疫法测定NO水平、免疫组化法测定eNOS蛋白和采用实时荧光定量PCR法测定eNOS mRNA表达。结果 与假手术组比较,各组NO水平,eNOS蛋白和eNOS mRNA表达均明显降低,差异具有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较,rhEPO动员组、丹参通络解毒汤组和丹参通络解毒汤联合动员组NO水平升高,eNOS蛋白和eNOS mRNA表达明显提高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与rhEPO动员组和丹参通络解毒汤组比较,丹参通络解毒汤联合动员组NO水平显著升高,eNOS蛋白和eNOS mRNA表达明显提高,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论 丹参通络解毒汤可以提高缺血心肌eNOS mRNA表达,进一步促进eNOS蛋白表达,升高NO水平,是该方保护心肌缺血再灌注损伤大鼠内皮重要机制之一,同时该方联合动员剂对内皮保护有增强促进作用。     

丹龙醒脑方对脑缺血再灌注大鼠海马区Notch信号通路相关蛋白表达的影响

目的 探讨丹龙醒脑方对脑缺血再灌注模型大鼠海马区Notch信号通路相关蛋白Notch1、Notch2及Hes1表达的影响。方法 将80只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、丹龙醒脑方小剂量组（丹小组7.4 g/kg）、大剂量组（丹大组14.8 g/kg）,线栓法建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,再灌注7 d取缺血侧海马组织。采用免疫组织化学法、免疫印迹法检测大鼠海马区Notch1、Notch2及Hes1蛋白表达。结果 与假手术组比较,各组Notch1、Notch2及Hes1蛋白表达显著升高（P<0.05,P<0.01）;与模型组比较,丹小组、丹大组Notch1、Notch2及Hes1蛋白表达显著升高（P<0.05,P<0.01）。结论 丹龙醒脑方能通过上调海马区Notch1、Notch2及Hes1蛋白表达水平,调节Notch信号转导通路,这可能是其促进脑缺血损伤后神经功能修复的机制之一。     

针刺联合亚低温对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织p-Raf1、p-ERK1/2的影响

目的 观察针刺联合亚低温疗法对脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分、细胞凋亡及p-Raf1、p-ERK1/2的影响。方法 参照ZeaLonga线拴法复制大脑中动脉缺血模型（MCAO）并加以改良,50只SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、针刺组、针刺联合亚低温组,每组10只,针刺及针刺联合亚低温治疗72 h后,观察神经功能缺损评分、TUNEL法检测凋亡细胞,Western Blot法检测大鼠缺血侧脑组织磷酸化Raf-1、ERK1/2蛋白的表达水平。结果 造模后,模型组大鼠神经功能缺损评分升高、凋亡细胞增多,磷酸化Raf1、ERK1/2蛋白的表达水平明显增高,与空白组及假手术组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。经治疗后,各治疗组神经功能缺损评分减少、凋亡细胞及磷酸化Raf1、ERK1/2蛋白的表达水平均明显降低,与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01）。与针刺组比较,针刺联合亚低温组神经功能缺损评分,磷酸化Raf-1、ERK1/2蛋白的表达水平下降,差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论 针刺及针刺联合亚低温均可改善神经功能缺损,调节p-Raf1、p-ERK1/2,减少细胞凋亡,对脑组织起保护作用,且联合组的脑保护作用更强。     

FSH激活的ERK1/2信号通路在GC细胞增殖分化过程中的作用

为探明由促卵泡刺激素(FSH)激活的胞外信号调节蛋白激酶1/2 (ERKl/2)通路在颗粒细胞(GC)增殖分化过程中的作用,以分离培养的SD大鼠GC为材料,研究了FSH激活的ERK1/2通路对GC增殖和分化的影响.结果显示:FSH快速诱导了ERK1/2的磷酸化,这种诱导作用具有时间依赖性,FSH作用0.33h时其磷酸化水平达到最高,用磷酸蛋白激酶A(PKA)的特异性抑制剂H89抑制PKA活性,显著降低了FSH和腺苷酸环化酶激活剂(forskolin)对ERK1/2的激活作用.以增殖细胞核抗原(PCNA)为GC增殖指标,以甾体生成快速调节蛋白(StAR)和甾体生成为GC分化指标,检测发现50 ng/mL的FSH以时间依赖方式诱导了PCNA蛋白的表达,FSH处理2h,PCNA蛋白水平达到最高;用UO126(ERK1/2的特异性抑制剂)阻断ERK1/2通路发现,FSH对PCNA和甾体生成的促进作用明显减弱;激光共聚焦检测结果进一步显示,与对照组相比,FSH组StAR信号明显增强,抑制ERK1/2活性显著降低了StAR的荧光强度.可见,FSH激活的ERK1/2通路促进了PCNA和甾体的生成,诱导了GC的增殖和分化.     

丹龙醒脑方对脑缺血再灌注大鼠半暗带区神经细胞凋亡与即早基因表达的影响

目的 探讨丹龙醒脑方对局灶性脑缺血再灌注大鼠大脑皮质半暗带（ischemic penumbya,IP）区神经细胞凋亡与即早基因c-fos、c-jun、c-myc表达的关系。方法 将48只雄性SD大鼠随机均分为假手术组,脑缺血再灌注（模型）组,尼莫地平组及丹龙醒脑方小、中、大剂量组（丹小组、丹中组、丹大组）。后五组用线栓法制备大脑中动脉栓塞再灌注（MCAO/R）模型,再灌注24 h进行神经功能缺损评分后,取缺血侧大脑皮质,采用原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡的神经细胞,免疫组化法分别检测c-fos、c-jun、c-myc蛋白。结果 与假手术组比较,其余各组的神经功能缺损评分、神经细胞凋亡指数（AI）及c-fos、c-jun、c-myc蛋白的积分光密度（IOD）值均升高,差异有统计学意义（P < 0.05,P < 0.01）;与模型组比较,尼莫地平组和丹龙醒脑方各剂量组的神经功能缺损评分、神经细胞AI及c-fos、c-jun、c-myc蛋白的IOD值均减小,差异有统计学意义（P < 0.05,P < 0.01）;尼莫地平组、丹龙醒脑方各剂量组组间比较,各指标差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 丹龙醒脑方能显著降低脑缺血后神经功能缺损和减少神经细胞凋亡,其机制可能与下调即早基因c-fos、c-jun和c-myc的表达有关。