培养液pH值对小鼠精子体外培养过程中活力及蛋白修饰的影响

为了探究不同pH对小鼠成熟精子体外培养过程中活力参数及蛋白修饰的影响,研究采用不同pH值(6.6~7.8)培养液培养小鼠精子2h,利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)、蛋白免疫印迹(WB)及免疫荧光技术,分析测定小鼠精子活力参数、蛋白修饰的变化情况,并对小鼠精子磷酸化蛋白及乙酰化蛋白进行细胞亚组分定位。结果显示,pH为7.2~7.4时精子能动性(sperm motility,MOT)、平均路径速度(path velocity,VAP)、平均直线运动速度(straight line velocity,VSL)和平均曲线运动速度(curvilinear veiocity,VCL)都有较高值,pH为6.6或7.8时精子活力受到显著抑制(P0.05);培养液的pH为7.4处理组,小鼠精子蛋白磷酸化、乙酰化和琥珀酰化修饰均达到较高水平,无论pH降低(7.2)还是升高(7.4)这些蛋白修饰水平都减弱,与精子活力参数变化趋势一致;免疫荧光定位结果显示,获能组磷酸化蛋白及乙酰化蛋白荧光强度明显高于未获能组,磷酸化蛋白及乙酰化蛋白遍布精子整个鞭毛区域,其中头部核区蛋白乙酰化修饰水平较高。上述研究表明pH值7.2~7.4为小鼠精子体外培养的最适pH值范围,pH值可能通过影响精子体外培养过程中的蛋白磷酸化、乙酰化及琥珀酰化作用调节精子活力及功能。本研究对探究pH值调控哺乳动物成熟精子活力的分子机理及体外培养具有重要意义。     

精浆浓度对17℃保存下猪精子活率和活力的影响

为了解精浆浓度对精子常温保存的影响,对含不同浓度精浆的商业化CXM稀释剂和自制稀释剂的精液于17℃下的保存效果进行比较.结果表明:当稀释剂为CXM时,25％精浆获得了最好的保存效果,含0、5％精浆也有较好的保存效果;而使用自制稀释剂时,含50％、75％精浆获得了较好的保存效果,其次是含25％精浆.说明在常温保存中一定浓度的精浆有利于维持精子的活力和活率,但这与稀释剂组成有关.在实际生产应用中,在稀释剂中约添加25％精浆对维持精子在常温保存中的活力和活率可能有较好效果.     

重金属铬对体外培养猪精子活力及蛋白磷酸化水平的影响

为探究铬元素在猪精子体外获能培养过程中,对猪精子活力、蛋白磷酸化信号通路的影响,研究采取八头杜洛克猪新鲜精液,分别在体外获能培养液中添加不同浓度的6价铬离子(0、0.1、0.5、1、2、10、100μmol/mL)以及双丁酰环腺苷酸(dbcAMP)、异丁基黄嘌呤(IBMX)、PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKAs信号通路调节因子进行调控培养2h。利用精子活力计算机检测(CASA)、蛋白质免疫印迹(WB)技术,分析测定猪精子体外铬暴露获能培养过程中精子活力、蛋白磷酸化水平,并用相应试剂盒检测细胞中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性、腺苷-3′,5′-环化一磷酸(cAMP)及ATP水平。结果表明:铬离子对猪精子活力、蛋白磷酸化水平有抑制作用,且随铬离子浓度增加抑制作用增强。当铬浓度达到2μmol/mL时精子活力MOT(58.4%)显著低于获能培养组(73.6%)(P0.05);10μmol/mL铬处理明显抑制蛋白磷酸化水平,且细胞内GAPDH活性、cAMP及ATP水平显著降低(P0.05)。而10μmol/mL铬处理中分别添加葡萄糖(5.0μmol/mL)及dbcAMP(1.0 mmol/L)和IBMX(0.1 mmol/L),能缓解铬对蛋白酪氨酸磷酸化(PTP)、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸化(P-PKAs)及GAPDH活性的抑制作用。结果提示铬可能是通过干扰糖代谢及cAMP/PKA信号通路影响猪精子活力及蛋白磷酸化水平。本研究首次探究了体外培养过程中铬离子对家畜精子活力的影响,并初步探究了其作用机理,为进一步研究铬离子引起繁殖毒性的分子机制及家畜繁育提供一定的理论基础。     

温度和保存时间对猪精子顶体酶活性的影响

分析了发展地方金融对推进安徽跨越式发展的重要意义，总结了当前安徽地方金融发展取得的成效，剖析了安徽地方金融发展中存在的一些问题，提出了制定安徽地方金融业中长期规划、推进合肥区域性金融中心建设、组建地方性金融控股公司、完善农村金融服务体系、大力发展资本市场等对策措施。     

钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力影响

研究主要探究钙离子(Ca2+)对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化及活力的作用。利用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)检测、蛋白免疫印迹测定不同Ca2+浓度对精子活力指标及蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响,并对精子样品的酪氨酸磷酸化蛋白的分布情况进行观察。结果显示,当Ca2+浓度≤1.0mmol/L时,精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平增高;然而,当Ca2+浓度≥3.0mmol/L时,则明显抑制精子活力和蛋白酪氨酸磷酸化水平,尤其分子量约为27和34kDa的高丰度蛋白磷酸化程度明显降低(P0.05)。高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制鞭毛处蛋白酪氨酸磷酸化。因此,细胞外钙离子对猪精子活力和蛋白磷酸化起到重要调节作用,低浓度Ca2+促进精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化,高浓度Ca2+(≥3.0mmol/L)抑制精子活力及蛋白酪氨酸磷酸化。本研究初步明确了Ca2+浓度对猪精子蛋白磷酸化及精子活力的影响,为进一步研究精子获能提供参考。     

猪精液保存及精子代谢与表观遗传调控研究进展

猪精液保存在科学理论研究和经济生产实际中都具有重要的意义。文章就国内外有关猪精液保存、精子代谢、精子冷冻过程中的表观遗传调控等研究进展进行了综述,并对猪精液保存的前沿发展与研究方向进行了展望,以期为进一步提高猪精液保存的品质,发挥良种优势提供理论依据。     

牛磺酸对猪精子负压17℃液态保存效果的影响

为研究猪精子在17℃负压液态保存时牛磺酸对精子质量的影响,通过在Modena基础稀释液中添加不同剂量的牛磺酸,17℃负压环境下进行猪精液的保存,并利用迈朗全自动精子质量检测仪等仪器检测猪精子质量、精液pH值及精液中H2O2浓度,研究不同浓度牛磺酸对猪精液质量的影响。实验共分5个处理组,即基础稀释液中添加0、2.5、5、7.5、10 mmol·L-1牛磺酸,实验重复4次。结果表明,7.5 mmol·L-1的牛磺酸在精子活力,路径速度上都明显优于其他组(P0.05);添加牛磺酸后精液的pH值下降缓慢,且精液中H2O2浓度较对照组有不同程度的下降。由以上实验结果可知,从综合指标上看7.5 mmol·L-1的牛磺酸对在17℃负压环境下进行猪精液的保存是有利的,为猪人工授精生产实践中猪精子的保存提供了实验依据。     

猪精子体外获能及异种穿卵的超微结构研究

 研究结果表明，猪精子头部长7.6微米，宽4.1微米。主要由核、顶体及顶体后区组成。顶体的内、外膜结构不同于质膜。颈部由中心粒和9条纵行分节的节柱组成。尾部全长49.4微米，其中，中段长11.4微米，线粒体较发达，约为52-55旋；主段中央是“9+2”的微管结构，其外方被9条致密纤维和纤维鞘包裹。体外获能前的猪精子群集成簇，运动缓慢。获能后运动方式发生变化，呈超激活运动特征。获能后的猪精子主要是以顶体外膜囊泡化的形式发生顶体反应。质膜是否参与囊泡化尚待进一步观察。顶体反应完成后，仅有顶体内膜包在精子核膜的外面。顶体内膜可与去透明带的金黄地鼠卵的细胞膜相融合，穿入卵内的精子核能在卵内去浓缩并发育成雄原核。本研究共分4批，对120枚金黄地鼠卵进行了观察，平均穿透率为84.8±10.2%。     

稀释液溶质组合及渗透压对鸡精子体外保存时间和形态的影响

研究了8种稀释液溶质精确的渗透压和用其配制的13种鸡精液稀释液对鸡精子的保存效果.结果显示,无机盐氯化钠、氯化钾在350 mmol/L渗透压浓度单独使用时可以获得较高的精子存活时间和精子生存指数,但不利于维持鸡精子细胞膜的完整性.有机盐柠檬酸钠、柠檬酸钾最佳的渗透压值应该在350~400 mmol/L.谷氨酸钠最佳渗透压不是等渗,而是偏低渗.3种有机盐溶液对鸡精子形态有保护作用。葡萄糖、蔗糖、果糖单成分液均有保护鸡精子形态完整的良好作用;最适渗透压浓度葡萄糖为250 mmol/L,蔗糖为200~250 mmol/L.氯化钠和氯化钾以5∶1比例制成350 mmol/L渗透压浓度溶液时可以获得比单独使用时更高的精子存活时间和生存指数,但不能改变无机盐对鸡精子细胞膜的破坏作用.250 mmol/L谷氨酸钠和450 mmol/L的果糖以1∶2组合后可以获得较为理想的鸡精子机能和形态保存效果.     

温度和保存时间对猪精子顶体酶活性的影响

为了探讨温度和液相保存时间对猪精子顶体酶活性的影响,采用紫外分光光度计检测猪精子顶体酶活性。结果显示:(1)鲜精、冷休克和热休克每106精子顶体酶活性分别为5.38、5.20和5.16 mIU,差异不显著(P>0.05)。(2)鲜精在4、17、25、30、37和39℃时每106精子顶体酶活性分别为4.29、5.01、5.03、5.17、4.78和4.61 mIU,随着温度的升高精子顶体酶活性逐渐提高,当温度达到30℃时达到最高,且4℃和30℃时差异显著(P<0.05)。(3)液相精液在4℃保存超过1 d时精子顶体蛋白酶活性显著下降(P<0.05);在17、25和39℃保存超过2 d时顶体酶活性显著下降(P<0.05),且在17℃保存效果较好。结论是猪精子顶体蛋白酶活性受温度的影响,在17℃的条件下3 d内保存的猪精子顶体酶活性最佳。     

不同稀释液对猪精子活力与保存时间的影响

通过研究不同配方的稀释液在相同的稀释倍数及同一保存条件下,对猪精子活力的影响来选择合适的猪精稀释液。试验选用灌南县家畜改良站内的4头成年公猪的精液作为材料,采用4种稀释液配方,分别进行稀释,观察精子活力和保存时间。结果表明,用葡—柠—乙液稀释的精液,在32h内精子活力平均数显著高于葡萄糖液和葡—柠液,精子存活时间也长于其它稀释液。     

猪精子内阳离子在保存、冷休克和快速冷冻中的变化

在37℃保存过程中,猪精子内K~ 、Ca~( )、Mg~( )和Zn~( )的水平有所下降,而Na~ 则有所升高。冷休克和快速冷冻都能使精子内的K~ 水平降低而Na~ 、Ca~( )和Zn~( )水平升高,Mg~( )的变化不大。分析结果表明:(1)精子内离子的变化同精子膜受损伤的程度有关;(2)猪精子内似乎具有在某些低温状态下与Zn~( )和Ca~( )结合的成分。     

猪精液稀释液中不同水质对精子活力的影响

通过对猪精液稀释液采用不同水质的试验研究，结果表明：无污染的高山矿泉水和质量好的蒸馏水作稀释用水的精子存活时间最长，而用天然河水作稀释用水的精子存活时间最短。     

内毒素对17℃环境下猪精子质量的影响

为探究不同浓度内毒素对17℃保存条件下猪精子质量的影响。在Modena基础稀释液中分别添加浓度为10^-7,10^-6,10^-5,10^-4 g/mL的内毒素,检测猪精子在此环境下5 d内的精子活率、活力、直线速度、路径速度和凝集指数。结果表明：10^-7 g/mL组的精子在4～5 d时,直线速度显著降低,而10^-6～10^-4 g/mL各组中的精子,各项质量指标显著降低,但各组精子的凝集指数差异不显著。猪精子对内毒素具有一定抗性,高浓度的内毒素影响精子的保存期;且内毒素不是引起精子大面积凝集的原因。研究为生产实践中猪精液的保存提供了试验依据。     

猪鲜精17℃保存剂效果对比试验

选择2种著名品牌猪精液常温保存稀释剂为对照组(对照一、对照二),试验组为本课题组经大量试验开发的猪精液常温保存稀释剂,旨在探讨研发的稀释剂对猪鲜精保存效果。试验结果表明,课题组研发的猪精液17℃常温保存稀释剂在有效保存时间和精子总存活时间方面均显著高于对照一组,而相对于对照二组,显著提高了大白种猪精液有效保存时间和精子总存活时间(P<0.05),其余各组差异均不显著(P>0.05)。试验中的3种不同稀释剂在前3d对精子质膜完整性均有较好保护作用, 3组间差异不显著(P>0.05);保存到第5天,试验组和对照二组中精子质膜完整性显著高于对照一组(P<0.05),但前2组之间质膜完整性无显著性差异(P>0.05);保存至第7天,对照一组、对照二组和试验组中精子质膜完整性分别为49.94±3.08, 58.83±2.22, 72.86±2.62,精子质膜完整性在该3组之间均存在差异显著性(P<0.05)。结果显示,在相同储存条件下,本课题组研制的精液常温保存剂对精液保存时间,质膜完整率等指标优于国内市场上著名品牌,且保存效果稳定。     

获能和冻融猪精子前顶体蛋白活化机制研究

利用SDS-PAGE和Western Blotting的方法,分析冻融和获能处理中猪精子前顶体蛋白的转化过程。结果表明,显示获能组精子荧光区域大于冻融组精子,而小于新鲜精子组;新鲜组精子出现大约45和35kDa分子量的条带,而冻融和获能组精子都同时出现大约45、35和28kDa分子量的条带。总之,冻融后顶体完整的精子和获能精子Proarosin都能正常活化成α-acrosin、β-acrosin和28kDa,这个途径可作为预测受精的指标。     

冷应激对猪精子活力的影响

我国北方建立公猪采精站后,生产上最大的隐患就是精液冷应激对精液质量产生负面影响,虽然冷应激的精液经过1h左右的缓冲是可以恢复原有活力的,但其生命力已大大减弱。对生产上使用冷应激精液配种的数据进行统计、对比、分析后发现,冷应激对精液生产的危害非常大。     

小鼠精子体外培养过程中Ca~(2+)对微管蛋白乙酰化的影响

微管蛋白的乙酰化作用对细胞代谢过程,维持细胞的稳定性及运动性具有特殊作用,而有关哺乳动物精子蛋白乙酰化修饰的研究报道较少,且成熟精子蛋白乙酰化作用机制尚未明确。本研究利用精子活力参数计算机辅助检测(CASA)技术、蛋白免疫印迹(WB)以及免疫荧光等实验技术,分析测定小鼠精子体外培养过程中,不同浓度Ca2+以及HCO-3、环腺苷酸(dbcAMP)等精子获能调节因子对微管蛋白乙酰化的影响。结果表明,小鼠精子中分子量约为55、37、26kDa微管蛋白发生乙酰化修饰,获能培养后微管蛋白乙酰化程度明显高于未获能培养;钙离子对精子运动能力以及微管蛋白乙酰化修饰起双重调节作用,低浓度Ca2+(≤2.0mmol/L)促进精子活力及微管蛋白乙酰化(P0.05),而高浓度Ca2+(4.0mmol/L)明显抑制精子活力MOT(48.88%)、曲线运动速度VCL(99.46μm/s)及微管蛋白乙酰化(P0.05);加入钙离子级联信号调节因子钙调蛋白抑制剂(W7)和钙调蛋白激酶抑制剂(KN-93),能有效缓解高浓度Ca2+(4.0mmol/L)对微管蛋白乙酰化的抑制作用,而钙离子载体(A23187)能进一步增强高浓度Ca2+对小鼠精子微管蛋白乙酰化的抑制作用;dbcAMP、异丁基黄嘌呤(IBMX)及PKA抑制剂(H-89)等cAMP-PKA磷酸化信号因子影响微管蛋白乙酰化,但不符合cAMP-PKA磷酸化信号通路调节规律。免疫荧光结果显示乙酰化微管蛋白主要分布在精子尾部的中段和主段,且主段最为明显。本研究提示Ca2+可能通过调节微管蛋白的乙酰化,从而影响精子的活力及受精能力。     

稀释液配方和稀释倍数对猪精子活力及运动参数的影响

为研究稀释液配方和稀释倍数对猪精子活力及运动参数的影响,筛选了5个稀释液配方,设计了6个稀释倍数,采用CASA系统检测精子活力、活动率、运动速度及运动方式等参数指标,利用SPSS 19.0软件中GLM程序进行分析表明,5个配方精子活力(PR)或精子活动率(PR+NP)中,F_2最高,F_3次之,但两者间差异不显著,与其他3个配方比较差异极显著;精子速度方面,同样以F_2最快,仍与F_3差异不显著,与其他配方差异显著或极显著;精子运动形式参数方面,WOB指标中,5个配方间差异均不显著;其他指标,F_2和F_3较高。稀释倍数上,就PR、PR+NP而言,两者均随稀释倍数的增大而表现出先上升后下降的趋势。因此,稀释液配方中,经典的猪稀释液配方为最优,确定配方为:葡萄糖5.0 g、柠檬酸钠0.3 g、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na);稀释倍数PR、PR+NP中,D_(0.5)最优,但从经济效益来看,D_1为最佳。