植物中Ac/Ds转座子的研究与应用

Ac/Ds转座子作为研究较为深入的植物转座子,已被广泛应用于植物功能基因组研究.利用Ac/Ds标签系统构建插入突变体库是研究功能基因组学的有效途径,也是进行基因克隆及功能分析的有利工具.结合课题组利用Ac/Ds转座子标签分离基因并进行基因功能验证方面的研究工作,综述了Ac/Ds转座子在植物基因组中的插入特点、转座机制以及转座子标签法的应用与发展前景,为更有效的利用Ac/Ds转座子提供参考依据.     

Ac/Ds转座子及其作为插入序列标签的应用

简要介绍了Ac/Ds转座子作为插入序列标签的构建形式及其在植物基因组中的插入特点、影响Ds转座子跳跃的因素,并且对其在植物功能基因组的发展前景作了分析。     

多转座子载体的构建及转座特性比较研究

【目的】转座子（transposon, Tn）是染色体上可自主复制和移位的基本单位,普遍存在生物体基因组内,Sleeping beauty（SB）、piggyBac（PB）和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼,是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率,从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol2 3种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件,测序正确后,将各转座元件依次亚克隆至pT2-HB载体框架,构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新霉素表达框PGK-NEO分别克隆至pT3-PST载体,获得两个表达载体pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒pCMV-SB100X、 pCMV-HAhyPBase、pCMV-Tol2以1﹕1质量比混合,经多聚阳离子PEI包裹,共转染小鼠胚胎成纤维细胞（3T3）,同时以突变失活的转座酶质粒SB△DD与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染GFP 36 h后,用荧光显微镜进行检测GFP表达率,提取细胞基因组,以Amp基因作为内参,进行实时荧光定量PCR,检测GFP插入拷贝数;根据被剪切位置上下游序列设计引物,进行实时荧光定量PCR,检测3种转座子的剪切效率。细胞转染NEO 48 h后,用浓度为500 µg·mL^-1的G418进行耐药性筛选,至正常细胞基本全部死亡（10 d）,将细胞进行吉姆萨染液染色,统计耐药细胞数,从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于50%,且差异不显著（P＞0.05）。SB组GFP相对拷贝数高于Tol2和PB组,但差异不显著（P＞0.05）,均显著高于对照组（P＜0.05）。SB和PB组剪切效率显著高于Tol2组（P＜0.05）,但SB和PB组之间差异不显著（P＞0.05）。pT3-PGK-NEO与转座酶共转染3T3细胞,G418抗性筛选结果表明,SB组耐药细胞数显著高于PB和Tol2组（P＜0.05）,但PB和Tol2两组差异不显著（P＞0.05）,此3组均极显著高于阴性对照组（P＜0.01）。【结论】SB转座子系统在细胞水平的转座效率优于PB和Tol2,为细胞水平的转基因研究提供有效基因转移工具。     

Ac/Ds转座子激活标签技术研究进展

随着植物基因组测序工作的迅速发展,植物功能基因组学已经成为植物分子生物学研究的重要内容,而大量有表型的突变体是进行功能基因组学研究的重要基础。Ac/Ds转座子激活标签技术(Ac/Ds transposonactivation tagging system)的产生使Ac/Ds转座子标签技术具有了产生显性突变的功能,并可避免在突变体库创建过程中进行大量繁重的人工转基因操作,是比较理想的植物功能基因组学研究工具。本文将对Ac/Ds转座子激活标签技术在发展过程中利用不同激活标签创建植物突变体库的研究进行介绍,并对近二十几年来报道的相关应用研究展开论述,以期对该领域的技术进步和应用研究提供一些有益的启发和参考。     

转座子应用的研究进展

转座子是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位,它存在于生物界的各个领域,转座子及其相关技术是后基因组时代用于研究基因组功能的生物技术。综述了转座子的分类、转座子的转座机制以及转座子的应用与发展前景。     

水稻Ds转座子转基因后代的抗性筛选

以水稻Ds转基因后代的种子为抗性筛选材料，建立了种子浸润发芽的抗性检测方法，研究表明以340～450mg·L     

一个链霉菌中微型转座子系统的构建

针对链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,构建了一个链霉菌中的微型转座子质粒pHL265,它携带的转座酶基因tnpA在转座子mini-Tn4560A外部,降低了发生二次转座的可能性,并带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过接合转移的方式将其从大肠杆菌导入到链霉菌中.利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1 000株转座突变株.选取其中的8株,经Southern杂交验证可知,该转座子的转座基本具有随机性,并在宿主DNA中稳定存在.此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了新的技术手段.     

利用转座子构建细菌突变体的原理及应用

转座反应在生物体的抗逆应激性反应、效应因子迁移等过程中扮演着重要角色,越来越多的转座元件被发现并应用于未知功能基因的发现、生物遗传特性与功能等研究。Tn3、Tn5、Tn10、Tn7来源于原核生物,Mariner来源于真核生物,其中Tn3属于TnA家族,采用复制型转座,其余采用非复制型转座。实际应用中,相对于Tn3、Tn5存在插入热点区域,Mariner和Tn10具有更高的插入频率和随机性,且得到更为广泛的应用。详细总结了广泛应用于芽孢杆菌、假单胞菌、黄单胞菌、劳尔氏菌等细菌研究领域的Tn3、Tn5、Tn10、Tn7、Mariner类转座子的分类、结构特点、转座过程和调控机制,以及最新的应用进展,为后续研究者提供了理论说明和应用建议。     

根癌农杆菌介导Ds转座因子的水稻遗传转化

以水稻品种中花１１的幼胚,成熟胚和幼惠的愈伤组织材料,经携带Ｔｉ质粒ｐＤｓ－Ｂａｒ１３００的根癌农杆菌ＥＨＡ１０５感染和共培养后,通过５０ｍｇ／Ｌ和２５ｍｇ／Ｌ潮霉素的二次筛选,结果表明：３４％经胚愈伤组织１７％成熟胚愈组织和１６．５％幼穗愈伤组织表现潮霉素抗性,这些抗性愈伤组织转入分化和再生培养基培养,获得了１４棵转基因植株,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析,证明Ｄｓ和Ｂａｒ基因都已整合进转基因植株的     

植物LTR类反转录转座子的研究概述

LTR类反转录转座子是植物基因组中的重要成分,对基因组的大小、结构、功能和进化都有重要影响.文中从结构特征、转座机制、分类、分离鉴定及对基因组的影响等多个方面概述了植物LTR类反转录转座子的研究进展,为进一步揭示LTR类反转录转座子在植物基因组中的功能奠定基础.     

利用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌的突变体文库

为了鉴定枯草芽孢杆菌定殖和促进植物生长相关基因,用携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA转化枯草芽孢杆菌OKB105菌株.高温诱变条件下,筛选了2 000个转座子插入突变的单克隆,构建了OKB105菌株的突变体文库.对随机挑选的15个突变体采用PCR及Southern杂交验证,结果表明:转座子TnYLB-1以单拷贝、随机方式插入到OKB105菌株的染色体上.     

燕麦C基因组反转录转座子分离与特异性标记的建立

燕麦属是禾本科中重要的属,其中,栽培燕麦是一种营养价值很高的粮、经、饲、药多用途作物,而野生物种中则含有多种优良农艺性状基因,是遗传改良的重要资源。基因组和染色体特异性的分子标记是分子育种工作的重要工具,以燕麦属不同倍性和基因组物种为材料,利用300条随机引物(random amplified polymorphic DNA,RAPD),从燕麦C基因组中筛选到一条基因组特异性序列OPR51655;比对和原位杂交发现,OPR51655为一Ty1-copia型反转录转座子重复序列,其同源序列分布于除端部和着丝粒外的整个染色体臂上;根据OPR51655建立了燕麦C基因组特异性(sequence-characterized amplified region,SCAR)标记,利用该标记能有效地检测燕麦栽培种和野生种中的C基因组染色质。     

辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列的克隆及分析

[目的]从辣椒基因组中克隆Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列,分析其家族特性及进化关系.[方法]根据Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶保守区域设计简并引物,通过PCR扩增、回收、克隆、测序得到的目的基因序列.[结果]克隆从辣椒基因组14条逆转录转座子逆转录酶序列,序列大小均为340 bp左右.生物信息学分析表明,序列长度变化范围为310 ～345 bp,同源性范围为60.2;～99.1;.这些核苷酸序列具有较高的异质性,主要表现为终止密码子突变.聚类分析可将所得序列分为5大类,基于逆转录酶序列进行的不同物种进化树分析显示,第Ⅳ、Ⅴ类序列与荸荠、潘那利番茄等组成一大类,可能是逆转录转座子横向传递的结果.[结论]辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列具有普遍性、异质性等特点,与荸荠、潘那利番茄等物种的同类型逆转座子可能有相同的起源.     

植物杂种优势遗传机制的分子遗传学研究进展

杂种优势是提高作物产量的重要途径。综述了针对植物杂种优势遗传机制的研究进展与现状，从分子水平上提出了杂种优势与QTL效应、基因组杂合性、基因表达调控及基因组互补的关系，并对植物杂种优势的研究方向进行了展望。     

毛竹长末端重复序列反转录转座子的全基因组特征及进化分析

  目的   研究毛竹Phyllostachys edulis基因组中的长末端重复序列反转录转座子(long terminal repeat retrotransposons, LTR-REs)的特征,为今后利用LTR反转录转座子对毛竹基因组的功能和对竹种资源遗传多样性的研究奠定基础。   方法   通过生物信息学方法,利用LTRharvest和RepeatMakser软件对第2版毛竹基因组中的LTR反转录转座子进行全面注释与分类,并对得到的LTR反转录转座子的分布特征、进化特性和插入时间进行分析。   结果   在毛竹基因组中共注释得到1 014 565个LTR反转录转座子,1 562个家族,占毛竹基因组的54.97%。其中solo LTR反转录转座子与完整LTR反转录转座子(S/F)的比例较高(约1.77∶1.00),表明在毛竹LTR反转录转座子中可能发生了相对较高频率的非法重组和不平衡重组。毛竹LTR反转录转座子分为Ty1-copia和Ty3-gypsy超家族,Tork、Reftrofit、Sire、Oryco、Del、Reina、Crm、Tat、Galadriel、Athila等10个谱系。毛竹LTR反转录转座子的Ty1-copia和Ty3-gypsy超家族对PBS位点的偏好性呈相反趋势,较长的LTR反转录转座子具有更长的LTR序列,结构也更加完整。毛竹LTR反转录转座子的插入时间主要集中在0~2.0 Ma,且还处于不断缓慢增长的状态。   结论   第2版毛竹基因组的高质量组装,能更好地注释和分析毛竹基因组中的LTR反转录转座子。基于结构预测的LTRharvest法,能更精准地预测毛竹LTR反转录转座子。不同谱系的毛竹LTR反转录转座子在进化过程中具有不同的分化和扩增活性。毛竹LTR反转录转座子总体上处于不断扩增状态,这是导致毛竹基因组较大的主要原因之一。图3表3参52     

短小芽孢杆菌转座突变株的GFP标记及在水稻上的定殖

【目的】研究GFP标记的短小芽孢杆菌在水稻植株上的定殖规律,为其生物防治应用提供科学依据。【方法】从短小芽孢杆菌GFP标记的转座突变株库中筛选强表达GFP且遗传稳定的突变株,用作水稻植株的定殖示踪。【结果】采用荧光酶标仪、流式细胞术检测及荧光显微镜观察等手段,对1 467株Tn5-egfp随机插入突变株的GFP表达作了定量和定性分析,最终获得8株荧光表达较强的突变株,并对突变株作了T-DNA插入拷贝数鉴定。在开放和封闭系统中,标记菌在水稻幼苗根际土壤中均可以存活15 d以上,且前者标记菌的数量下降相对更慢。【结论】短小芽孢杆菌在根毛区及侧根分生处的数量最多,并在根表面形成菌膜。该菌可通过水稻幼苗根部的伤口或幼嫩根毛等部位侵入根系,主要分布在皮层细胞及其间隙,在植物的维管束内亦可观察到荧光标记菌。研究结果表明该菌在水稻幼苗根际土壤中有着良好的定殖能力。     

副猪嗜血杆菌EZ-Tn5转座子插入突变体库的构建及减毒株的筛选

[目的]获得副猪嗜血杆菌减毒株。[方法]应用转座子技术构建转座子插入突变体库,卡那抗性筛选阳性菌株,PCR扩增卡那特异片段去除假阳性,小鼠感染试验检测突变株毒力,并对获得的减毒株进行生物学特性检测。[结果]所获得减毒突变菌株具有与野毒株相似的增殖能力,传代后毒力稳定,遗传学特性稳定。[结论]该研究结果为进一步探讨HPS毒力因子、致病机制奠定了基础。