团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala) HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明：（1）团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;（2）RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h（20 hours post fertilization, 20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h（40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;（3）HoxB1b基因在团头鲂成鱼部分组织或器官中有表达,且在雌雄鱼中基因表达量有一定差别。综上所述,团头鲂HoxB1b基因的功能与胚胎前后轴上的后脑和胸鳍发育密切相关,并在团头鲂成鱼相关组织中具有重要生理功能。     

团头鲂HoxB3a基因全长cDNA克隆及表达

Hox基因是脊椎动物一类重要的生长和发育调节基因,其所编码具螺旋-转角-螺旋结构的转录因子能与靶基因特定区域DNA结合,从而调节动物胚胎发育过程中体轴的形成和器官组织的生长.本研究采用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂HoxB3a的全长cDNA,并对团头鲂不同时期的胚胎和成鱼的不同组织进行了RT-PCR分析,以探索HoxB3a基因的时空表达特征.序列比对分析结果显示,团头鲂HoxB3a编码的氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、大西洋鲑(Salmo salar)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryzias latipes)、条纹鲈(Morone saxatilis)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的相似性分别为96%、85%、77%、76%、78%、66%和67%,同源性较高,这说明HoxB3a基因在长期的进化中具有较高保守性.RT-PCR结果表明,团头鲂HoxB3a基因从16 hpf(hours post fertilization)胚胎期到出苗期都有表达,在成鱼大部分器官或组织中具表达活性,预示该基因存在着重要的生物学功能.Hoxb3a基因全长cDNA的克隆、胚胎不同阶段表达及组织细胞表达特征研究,为进一步探索该基因的发育通路奠定了基础.     

团头鲂SREBP1基因的克隆及其表达分析

为阐明团头鲂SREBP-1的功能,采用RT-PCR技术克隆获得SREBP-1基因的cDNA序列,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SREBP-1基因在不同发育时期及不同组织中的表达情况。生物信息学分析发现,SREBP-1基因cDNA的编码序列(coding sequence,CDS)为3 426bp(GenBank登录号:MH633449),开放阅读框(ORF)编码1 141个氨基酸,与大西洋鲑、斑马鱼、草鱼、鲤、金线鲃SREBP-1的氨基酸序列相似性较高(74%～99%)。保守结构域分析显示,团头鲂SREBP-1蛋白具有SREBPs家族典型的"碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链"(bHLH-Zip)结构域。表达分析结果显示,SREBP-1基因在团头鲂胚胎发育过程中的表达呈现先下降后增高的趋势,在眼囊期最低,至出膜期达到最高。在团头鲂幼鱼中,SREBP-1在脑组织中的表达量最高,其次是眼、肝脏、心脏、肌肉、脂肪组织、肾脏,鳃中表达量最低。在成鱼中,SREBP-1在脑组织表达量最高,其次是性腺组织、肌肉、肝脏、眼,肾脏、脾脏和心脏中的表达量较低。以上结果表明,SREBP-1基因在团头鲂幼鱼和成鱼的不同组织中的表达模式存在差异。     

团头鲂β-防御素1基因 cDNA的克隆、序列分析及表达特征

从团头鲂(Megalobrama amblycephala)中克隆出β-防御素1(maBD-1)基因,检测该基因在组织中的分布,及在病原菌感染后该基因表达量的变化情况。将maBD-1基因重组到pGEX-KG原核表达载体上,构建重组质粒pGEX-KG-maBD-1,重组质粒经转化至BL21感受态细胞中进行诱导表达,将融合蛋白免疫日本大耳白兔,制备该融合蛋白的多克隆抗体,并检测血清效价。结果表明:maBD-1基因ORF全长为204bp,编码67个氨基酸。该基因在组织中广泛分布,病原菌感染后头肾和脾脏组织maBD-1基因表达量显著上调。经间接酶联免疫分析(ELISA)获得的抗血清效价为1∶3 200,在肝脏、鳃和心脏组织中用Western blot可检测到β-防御素的表达。     

团头鲂肌腱发育相关基因tnmd/xirp2a的克隆和表达

为分析肌腱发育相关基因tnmd/xirp2a与团头鲂肌间骨发育之间的相关性,通过克隆获得团头鲂tnmd/xirp2a的cDNA序列,其中tnmd的cDNA全长为1 420bp,开放阅读框为906bp,共编码301个氨基酸;xirp2a的cDNA全长为11 715bp,包括开放阅读框9 522bp,编码3 174个氨基酸。系统进化研究表明,tnmd/xirp2a基因在不同脊椎动物中保守性很低,且相比哺乳类和家禽类,鱼类tnmd基因存在一段氨基酸的缺失。采用荧光定量方法比较分析tnmd/xirp2a在团头鲂成鱼不同组织及肌间骨发生发育4个关键时期的表达情况,结果显示,tnmd/xirp2a在肌肉和肌间骨中的表达量均显著高于其他组织,且肌肉中tnmd基因表达高于肌间骨(P0.05),而xirp2a在肌间骨中的表达高于肌肉组织(P0.05)。在肌间骨发育4个关键时期(Ⅰ:尾部尚未出现肌间骨;Ⅱ:尾部出现少量肌间骨;Ⅲ:尾部肌间骨大量出现且长度增加;Ⅳ:肌间骨从尾部到背部全部出现且形态成熟)中,tnmd在第Ⅲ时期的表达水平显著高于另外3个时期;在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时期之间,xirp2a的表达水平没有显著性差异。此结果表明,tnmd基因在肌间骨的发育过程中存在潜在作用,而xirp2a基因与肌间骨的发育之间的相关性还需进一步研究。     

团头鲂jphs家族基因的克隆及表达分析

以团头鲂为研究对象,扩增获得Junctophilin(Jph)家族4个成员,jph1a、jph1b、jph2和jph3的cDNA编码序列,分别为2 031、2 016、2 358和2361 bp,分别编码676、671、785和786 aa。团头鲂jphs均由5个外显子和4个内含子组成,与大多数物种的JPHs基因结构相似;结构域预测显示出8个MORN和1个TM结构域,且蛋白多序列比对分析显示Jphs在进化上非常保守。基于qRT-PCR(quantitative real-time PCR)分析显示,这4个基因呈现出组织特异性表达,其中jph1a、jph1b和jph2主要在肌肉和心脏中表达,而jph3主要表达于心脏、血液和大脑。在早期发育过程中,jph1a、jph1b、jph2和jph3的mRNA表达模式类似,分别在原肠胚期、心跳期和25 dph(days post hatching)达到高峰。综上研究结果表明,鱼类jphs基因在心脏和肌肉等组织中发挥重要作用,并且其功能可能不同于哺乳动物。     

团头鲂SPATA4基因的分子克隆及表达分析

采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术从团头鲂精巢中克隆出精子发生相关基因4(spermatogenesis associated gene 4,SPATA4).该基因cDNA全长为1 076 bp,包括1个678 bp的完整阅读框架,编码225个氨基酸,预测的氨基酸序列的分子质量为25.72 ku,等电点为9.32.序列分析显示团头鲂SPA-TA4基因与其他脊椎动物同源性较高.荧光定量PCR结果显示SPATA4基因在受精后1～206 h期间,该基因在受精后4h和受精后28 h的表达量最高,在受精后50 h表达量最低,而在其他时期的表达水平基本一致;在所检测的10个组织中,SPATA4基因在精巢中的表达量最高.     

团头鲂SPATA4基因的分子克隆及表达分析

采用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术从团头鲂精巢中克隆出精子发生相关基因4（spermatogenesis associated gene 4,SPATA4）。该基因cDNA全长为1 076 bp,包括1个678 bp的完整阅读框架,编码225个氨基酸,预测的氨基酸序列的分子质量为25.72 ku,等电点为9.32。序列分析显示团头鲂SPATA4基因与其他脊椎动物同源性较高。荧光定量PCR结果显示SPATA4基因在受精后1～206 h期间,该基因在受精后4 h和受精后28 h的表达量最高,在受精后50 h表达量最低,而在其他时期的表达水平基本一致;在所检测的10个组织中,SPATA4基因在精巢中的表达量最高。     

团头鲂主要组织相容性复合体Ⅰ类基因全长cDNA的克隆及组织表达分析

为了解团头鲂MHCⅠ类基因的结构,采用cDNA末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术,首次成功克隆了团头鲂“浦江I号” F₀基础群体及选育F₈世代的MHCⅠ类基因,共获得3条cDNA全长序列。序列全长为2 040～2 079 bp,含有87~102 bp的5′-UTR,1 035～1 044 bp的编码区（包括信号肽,alpha 1、alpha 2和alpha 3三个结构域,跨膜区和胞质区）及911~946 bp的3′-UTR区,分别编码347、344个氨基酸。F₈世代序列的核苷酸/氨基酸的同源性很高,为89.0%/93.0%,而与F₀世代的同源性较低（75.3%~77.0 % 和71.1%~71.4%）,呈现出明显的分子多态性。分析表明,团头鲂具有经典的MHCⅠ类分子的空间结构,与人类HLA-A2的抗原肽结合区的晶体结构相比,二者的差异主要集中在5个(I~V)区上。在Neighbor-joining(NJ)法构建的分子进化树中,团头鲂与草鱼的亲缘关系最近,与鲑鳟鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类及人类的亲缘关系则渐远。RT-PCR组织表达分析表明,团头鲂MHCⅠ类基因在所检测的的8个组织中均表达,在鳃、头肾和血液中有较强的转录本,中等强度表达于肝脏和脾脏,在后肾、肠和肌肉中表达较弱。     

玉米光周期反应及一个相关基因的克隆

【目的】研究玉米的光周期反应，克隆出玉米中的EMF同源基因并研究其表达模式。【方法】以热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系黄早四为材料，研究了它们在9 h和15 h光周期处理后的反应和热带自交系CML288在不同时期两种日照挪动处理下的光周期反应。通过RT-PCR法克隆到一个玉米上的EMF同源基因，并检测了该基因在经过不同光周期处理的自交系CML288、黄早四及其F1的不同生长时期茎尖中的表达。【结果】 CML288对光周期的反应非常敏感，黄早四相对不敏感。CML288在短日照条件下7片叶时期是光周期反应的敏感时期，在长日照条件下9片叶时期是光周期反应的敏感时期。推测新克隆的cDNA序列含有完整的1 881bp的开放阅读框，编码一条约71kD的多肽，包含626个氨基酸残基，编码的蛋白质有一个C2H2型锌指结构区,两个核定位信号区和一个酸性区，可能是DAN结合蛋白，Northern杂交显示，其在茎尖和叶片中均有表达。经不同光周期处理后，该基因在2个自交系及F1不同生长时期茎尖中的表达情况不同。【结论】克隆到的基因其功能可能与促进营养生长和抑制生殖生长有关。     

鄱阳湖团头鲂的生物学研究

报道了鄱阳湖团头鲂的生物学特性 ,包括主要性状、食性、繁殖习性与繁殖力、年龄与生长、耗氧量和窒息点、肌肉成分、染色体组型和同工酶等方面     

团头鲂低氧耐受相关SNPs标记的开发

为寻找耐低氧相关SNPs分子标记辅助团头鲂优良品种选育,利用团头鲂低氧耐受和敏感群体的转录组数据,进行SNPs位点的开发和鉴定,获得52 623个可能的SNPs位点,其中碱基转换和颠换型位点分别占57.4%(30 192个)和31.9%(16 802个);同义SNPs占编码区总SNPs的99.7%,非同义SNPs仅有32～35个;使用PCR-RFLP技术对筛选出的5个非同义的多态性SNPs进行耐低氧性状关联分析。结果显示,Plin2-A1157G和Hif-3α-A2917G位点的SNPs在团头鲂亲本群体中与低氧耐受性状显著相关,但在子代群体中却与低氧耐受性状无显著相关性。这说明亲代中筛选出的分子标记并不一定适用于子代群体,在利用分子标记辅助育种时需要考虑标记在子代中的有效性。     

风干武昌鱼中微生物变化及理化性质的分析

[目的]分析风干武昌鱼生产过程中微生物数量和理化指标的变化。[方法]按总茵数、乳酸菌、葡萄球菌和酵母茵几个大类研究其微生物变化情况;理化方面,分析了pH、水分含量、水溶性固形物、水溶性蛋白氮及挥发性盐基氮几项重要指标。[结果]乳酸菌为风干武昌鱼发酵过程中的优势菌群;各种微生物复杂变化的同时导致产品pH和水分含量下降,水溶性固形物和水溶性蛋白氮的含量增加;产品的挥发性盐基氮含量符合国家标准。[结论]该研究为风干武昌鱼的标准化生产体系的建立以及稳定生产奠定了基础。     

团头鲂血清甲状腺激素浓度的周年变化

运用双抗体放射免疫测定法研究团头鲂（Ｍｅｇａｌｏｂｒａｍａ ａｍｂｌｙｃｅｐｈａｌａ）血清中甲状腺素（Ｔ４）和三碘甲腺原氨酸（Ｔ３）浓度的周年变化。血清Ｔ４和Ｔ３在春季性腺迅速发育时期形成峰值,Ｔ４的升高比Ｔ３早一个月。繁殖期后。血清Ｔ４和Ｔ３水平降低,血清Ｔ４分别在８月和１０月出现两个小峰;Ｔ３在７月－１１月维持较稳定的水平。血清Ｔ４、Ｔ３在冬季的水平均较低。对血清甲状腺激素在春季升高的生理意义作了讨论。     

梁子湖团头鲂的年龄和生长特征

为了解梁子湖团头鲂Megalobrama amblycephala的种群现状,于2011年7月-2012年6月采集310尾样本,以鳞片作为鉴定材料,对团头鲂的年龄和生长特征进行研究.结果表明：团头鲂年轮环纹呈疏密切割型,偶见幼轮,3龄以上个体可见生殖痕;种群体长分布范围为74.1～362.8mm,优势体长为180 ～320 mm,占群体总数的81.29％;群体由1～6龄共6个龄组组成,优势年龄组为3～4龄,占总渔获物的55.48％;体长（L）与鳞径（R）呈线性关系,关系方程为L=34.656R＋25.21;体长与体质量（W）呈幂函数关系,关系方程为W=1×10-5L3.1228,幂指数接近3,属匀速生长型;拟合Von Bertalanffy方程为Lt=452.36（1-e-0.2407（t＋0.2813））,Wt=2034.61（1-e-0.2407（t＋0.2813））3.1228,生长拐点时间ti=4.46龄,此时体长Li=307.78 mm,体质量Wi=607.70 g.研究表明,梁子湖的团头鲂资源量日趋减少,种群出现了明显的小型化趋势,应当采取保护措施,以利于资源的恢复和增殖.     

团头鲂血清甲状腺激素浓度的周年变化

运用双抗体放射免疫测定法研究团头鲂（Ｍｅｇａｌｏｂｒａｍａ ａｍｂｌｙｃｅｐｈａｌａ）血清中甲状腺素（Ｔ４）和三碘甲腺原氨酸（Ｔ３）浓度的周年变化。血清Ｔ４和Ｔ３在春季性腺迅速发育时期形成峰值,Ｔ４的升高比Ｔ３早一个月。繁殖期后。血清Ｔ４和Ｔ３水平降低,血清Ｔ４分别在８月和１０月出现两个小峰;Ｔ３在７月－１１月维持较稳定的水平。血清Ｔ４、Ｔ３在冬季的水平均较低。对血清甲状腺激素在春季升高的生理意义作了讨论。     

团头鲂hepcidin基因单核苷酸多态性及与抗病性状的相关性

为了解hepcidin(铁调素)基因的多态性及其与抗病性状的相关性,以团头鲂(Megalobrama amblycephala)为研究对象,从公共数据库中获得hepcidin基因序列,对团头鲂进行嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)人工感染来区分易感和抗病个体,采用PCR扩增及测序技术筛选hepcidin基因序列中的SNP(单核苷酸多态,single nucleotide polymorphisms)位点,对SNP位点运用高分辨率熔解曲线法(high-resolution melting,HRM)进行分型,分析其多态性及与抗病性状之间的关系。结果在hepcidin基因上共筛选出2个SNP位点,其中1个位点位于内含子部分,1个位于3′非编码区。经过统计分析发现,位于3 371bp(A/G)的这一SNP位点的基因型频率和等位基因频率在易感和抗病组间差异极显著,位于217bp(A/G)位点的基因型频率和等位基因频率在易感组和抗病组间差异显著。据此推测hepcidin的这2个SNP位点多态性与团头鲂抗病性状相关。