三角帆蚌AMP基因cDNA全序列的克隆及分子特征研究

以三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）为研究材料,根据实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用RACE克隆了三角帆蚌AMP基因的cDNA全序列。该cDNA序列全长为970 bp,5′端非翻译区123 bp,3′端非翻译区526 bp,开放阅读框（ORF）长为300 bp,共编码99个氨基酸,包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽,分子量为10 924.7 u。氨基酸序列分析表明,该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与海兔（Aplysia californica）theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%,而与贻贝等中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins相似度较低,推测属于抗菌肽theromacin基因家族。Jpred3软件对三角帆蚌AMP蛋白的二级结构预测结果表明,在第2～22、57～62氨基酸残基处存在α螺旋,因此,三角帆蚌的AMP蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。为进一步研究该基因的表达、功能及三角帆蚌病害防御奠定了分子基础。     

三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因的cDNA序列克隆与表达分析

[目的]研究三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[方法]通过RACE技术,以我国重要的淡水珍珠贝——三角帆蚌为研究客体,克隆了CaM的cDNA全长,并通过Real-Time Q-PCR技术分析了该基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[结果]三角帆蚌CaM基因cDNA全长659bp,包括70 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR和447 bp的ORF,编码149个氨基酸,预测其分子量为16.8 kDa,等电点为4.14。cDNA序列比对信息表明三角帆蚌与池蝶蚌、合浦珠母贝间均具有57%的相似度,而其蛋白具有高度的保守性,除斑马鱼外,各生物CaM相似率达97%。定量数据表明,CaM基因广泛表达于三角帆蚌各组织,外套膜内膜与腮中表达量显著升高(P0.05),其次是外套膜外膜和内脏团组织。插核育珠能增加该基因在各组织的表达,特别是在外套膜外膜和鳃组织中,育珠蚌该基因的表达显著高于非育珠蚌(P0.05)。此外,水体Ca2+浓度的增大对CaM基因表达有显著的影响,外套膜内膜该基因的表达随Ca2+浓度升高而增加,而外套膜外膜1.25 mmol/L Ca2+浓度下该基因的表达水平显著高于0.50 mmol/L、3.00 mmol/L组(P0.05)。[结论]为进一步深入研究钙调蛋白基因的在珍珠生长过程中的功能及其调控机理奠定了分子基础。     

茶树AMP脱氨酶基因的克隆与序列分析

茶树AMP脱氨酶是茶树咖啡碱合成途径的关键酶,它的活性影响着咖啡碱的的合成,但该酶基因的克隆目前还处于空白状态。通过从茶树全器官转录组文库搜寻的序列进行比对,获得1条与其他物种同源性较高的编码AMP脱氨酶基因的EST序列,运用RACE技术扩增获得茶树AMP脱氨酶基因的cDNA全长序列。该基因cDNA全长3 215 bp,其中开放阅读框长2 571 bp,编码856个氨基酸,3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号。预测蛋白分子量为97.6 kDa,理论等电点为6.31。序列分析表明它与葡萄的AMP脱氨酶基因的亲缘关系较近。将基因登陆到GenBank上,登录号为AGJ84350.1。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用,利用RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)克隆了其cDNA全长,使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织(性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜)、早期发育阶段(1～8月龄)性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异,运用...     

池蝶蚌与三角帆蚌种群的遗传变异分析

采用不连续聚丙烯酰胺垂直板电泳技术和特异性染色方法,对池蝶蚌和三角帆蚌两个种群的4个年龄段和4种组织(外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃)中的两种同工酶(EST、MDH)进行分析。结果表明,这两种贝类的同工酶具有明显的组织特异性,且三角帆蚌种群的遗传多样性较池蝶蚌种群丰富。     

池蝶蚌与三角帆蚌种群的遗传变异分析

采用不连续聚丙烯酰胺垂直板电泳技术和特异性染色方法,对池蝶蚌和三角帆蚌两个种群的4个年龄段和4种组织(外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃)中的两种同工酶(EST、MDH)进行分析。结果表明,这两种贝类的同工酶具有明显的组织特异性,且三角帆蚌种群的遗传多样性较池蝶蚌种群丰富。     

三角帆蚌病害及防治技术研究进展

通过20年来的发展,我国珍珠产量超过了1200t,稳居世界首位,成为又一种能够在国际市场占有重要地位的产品之一。目前,我国珍珠产量的90％以上是淡水珠,而其中95％以上是三角帆蚌生产的,但是对三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）生物学基础研究以及相关应用技术研究远远跟不上生产发展的需要。近10年来蚌病在大范围内此起彼落频繁发生,成为制约淡水珍珠养殖发展的主要瓶颈之一。本文通过对三角帆蚌蚌病及其防治技术的最新研究和进展情况进行综述,为进一步发展淡水珍珠业提供基础资料。     

三角帆蚌病害及防治技术研究进展

通过20年来的发展，我国珍珠产量超过了1200t，稳居世界首位，成为又一种能够在国际市场占有重要地位的产品之一。目前，我国珍珠产量的90％以上是淡水珠，而其中95％以上是三角帆蚌生产的，但是对三角帆蚌（Hyriopsis cumingii Lea）生物学基础研究以及相关应用技术研究远远跟不上生产发展的需要。近10年来蚌病在大范围内此起彼落频繁发生，成为制约淡水珍珠养殖发展的主要瓶颈之一。本文通过对三角帆蚌蚌病及其防治技术的最新研究和进展情况进行综述，为进一步发展淡水珍珠业提供基础资料。     

一种三角帆蚌肌浆网Ca2+-ATP酶基因cDNA的全长克隆与表达分析

采用RACE技术,从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)鳃组织中成功克隆得到一种肌浆网Ca²⁺-ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA)基因的全长cDNA序列,共3 326 bp,包含201-bp 5’-UTR区域、3 060-bp编码框(ORF)和65-bp 3’-UTR。ORF共编码1 019个氨基酸,预测无信号肽。该基因氨基酸序列呈现出典型的Ca²⁺-ATP酶特征,由Cation_ATPase_N、E1-E2_ATPase、Hydrolase、Cation_ATPase_C四种类型结构域组成,其内含SERCAs的常见结构组成包括磷酸化区域、异硫氰酸荧光素位点、FSBA结合位点、受磷蛋白结合区以及毒胡萝卜素位点。分析显示,该基因序列高度保守且与海洋软体动物具有最高同源性。荧光定量PCR检测,该基因在三角帆蚌外套膜、斧足、鳃、肝胰腺、性腺等5个组织中均有表达,且在鳃、外套膜、肝胰腺组织中表达较高。不同Ca²⁺浓度处理试验的结果表明,随水体中Ca²⁺浓度逐渐升高,该基因在外套膜中的表达水平呈先下降后上升趋势,并在Ca²⁺浓度为60 mg·L^-1时达到最低值,80 mg·L^-1时达到最高值。同时在60 mg·L^-1 Ca²⁺浓度条件下,外套膜中SERCA基因的表达量随时间推移先上升,并于48 h时达到最高,而后逐渐下降。上述结果为进一步深入研究SERCA基因的功能及其调控机理奠定了基础。     

三角帆蚌细胞周期蛋白基因筛选及其表达分析

细胞周期蛋白(cyclin)对细胞生长繁殖起到关键的调节作用。该研究采用高通量测序技术,构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)转录组文库,进行了cyclins基因筛选与生物信息分析,通过qRT-PCR技术,探讨其在不同组织(闭壳肌、内脏团、外套膜、斧足、心脏、血液、鳃、性腺)与性别中的表达特征。转录组测序共得到257 457条unigene(N50为1 796 bp),注释率为86.7%;通过分析,cyclin A、cyclin D2、cyclin E被筛选出,且cyclin A、cyclin D2与cyclin E蛋白的氨基酸序列均与美洲牡蛎(Crassostrea virginica)、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)具有较高相似性。实时荧光定量分析结果表明,cyclin A、cyclin D2、cyclin E在三角帆蚌各组织中均有表达,且存在显著的组织差异:cyclin A、cyclin E基因在性腺中表达量显著高于其他组织(P<0.05),在斧足中表达量最低;cyclin D2基因在鳃中表达量最高(P<0.05),在血液中表达量最低。在同一组织的不同性别之间:cyclin A基因在性腺、闭壳肌、心脏、血液中表达存在显著性别差异(P<0.05);cyclin D2在外套膜、心脏、性腺中的表达具有显著(P<0.05)的性别差异;cyclin E在性腺、斧足、鳃、心脏中的表达具有显著(P<0.05)的性别差异;cyclin A、cyclin E基因在雌性心脏和性腺中表达量显著(P<0.05)高于雄性,而cyclin D2反之(P<0.05),cyclin D2基因在雌性外套膜表达量显著高于雄性(P<0.05),暗示cyclin A、cyclin E与性腺发育关系密切,cyclin D2可能与鳃损伤修复有关。本研究初步探究了三角帆蚌cyclin A、cyclin D2、cyclin E基因的功能,为建立三角帆蚌细胞系提供了分子基础。     

三角帆蚌、池蝶蚌及其杂交F1代早期形态差异分析

测量了三角帆蚌(S)和池蝶蚌(C)及其杂交F1代(SS,CC,S♀×C♂,C♀×S♂)8月龄时的11个外部形态特征数据,使用壳长校正样本规格差异后,分别进行聚类分析、主成分分析和判别分析。聚类分析及主成分分析的结果均表明正交F1代(SC)的体型偏于母本三角帆蚌,而反交F1代(CS)的体型则介于两亲本之间。三角帆蚌与池蝶蚌之间的判别准确率较高,综合判别率达81.16%,引入正反杂交F1代进行判别则综合判别准确率下降至57.46%。以上结果暗示三角帆蚌与池蝶蚌之间的亲缘关系有可能高于现在普遍认为的种间关系。     

三角帆蚌、池蝶蚌及其杂交F1代早期形态差异分析

测量了三角帆蚌(S)和池蝶蚌(C)及其杂交F1代(SS,CC,S♀×C♂,C♀×S♂)8月龄时的11个外部形态特征数据,使用壳长校正样本规格差异后,分别进行聚类分析、主成分分析和判别分析。聚类分析及主成分分析的结果均表明正交F1代(SC)的体型偏于母本三角帆蚌,而反交F1代(CS)的体型则介于两亲本之间。三角帆蚌与池蝶蚌之间的判别准确率较高,综合判别率达81.16%,引入正反杂交F1代进行判别则综合判别准确率下降至57.46%。以上结果暗示三角帆蚌与池蝶蚌之间的亲缘关系有可能高于现在普遍认为的种间关系。     

紫穗槐4-香豆酸:CoA连接酶基因的克隆和结构分析

该文利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法从紫穗槐(Amorpha fruticosa)茎中克隆了木质素生物合成过程中重要的酶4-香豆酸:CoA连接酶(4CL)的cDNA全长序列,避免了复杂的构建、筛选cDNA文库的过程.所获得的全长4CLA cDNA,有1 911个碱基,包含一个完整的阅读框架,编码540个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明4CLA 是典型的4CL蛋白,含有预计的AMP-binding 位点,接触反应区和保守的Cys.     

三角帆蚌、池蝶蚌及杂交F1代养殖效果与育珠性能的比较

使用三角帆蚌、池蝶蚌作为亲本进行自交与杂交,获得了4群体F1。对实施手术无核插片手术后1年、2年、3年的4群体F1的养殖效果与育珠性能进行了比较。结果表明,在各年龄组育珠性能方面,反交F1>池蝶蚌>正交F1>三角帆蚌,且反交F1具有显著杂交优势;正交F1在壳长、成活率方面具有一定杂交优势,其它方面指标均低于池蝶蚌,略高于三角帆蚌。实施插片手术3年的反交F1较同龄的三角帆蚌每只蚌平均产珠重量增加31.96%,大规格珍珠(Φ>8 mm)比例增加2.71倍,成活率提高20.14%;较同龄的池蝶蚌每只蚌平均产珠重量增加14.95%,大规格珍珠(Φ>8 mm)比例增加54.01%,成活率提高10.14%。     

三角帆蚌、池蝶蚌及杂交F1代养殖效果与育珠性能的比较

使用三角帆蚌、池蝶蚌作为亲本进行自交与杂交,获得了4群体F1。对实施手术无核插片手术后1年、2年、3年的4群体F1的养殖效果与育珠性能进行了比较。结果表明,在各年龄组育珠性能方面,反交F1>池蝶蚌>正交F1>三角帆蚌,且反交F1具有显著杂交优势;正交F1在壳长、成活率方面具有一定杂交优势,其它方面指标均低于池蝶蚌,略高于三角帆蚌。实施插片手术3年的反交F1较同龄的三角帆蚌每只蚌平均产珠重量增加31.96%,大规格珍珠(Φ>8 mm)比例增加2.71倍,成活率提高20.14%;较同龄的池蝶蚌每只蚌平均产珠重量增加14.95%,大规格珍珠(Φ>8 mm)比例增加54.01%,成活率提高10.14%。