东农冬麦1号TabZIP1基因的生物信息学分析及低温和ABA对其表达模式的影响

为探讨小麦中TabZIP1应答低温胁迫及ABA调控信号的响应机制,以强抗寒性冬小麦品种东农冬麦1号(DN1)和弱抗寒性品种济麦22(JM22)为材料,在大田自然降温条件下,分别于5℃、0℃、-10℃、-25℃取样叶片和分蘖节,通过RT-PCR分析TabZIP1的表达模式,于不同温度下探究ABA对DN1分蘖节TabZIP1表达模式的调控,并对其生物信息学进行分析。结果表明,TabZIP1全长1 167bp,编码388个氨基酸,其表达产物为疏水蛋白,定位于线粒体,无信号肽或跨膜结构域;TabZIP1蛋白二级结构为mixed型。DN1叶片和分蘖节中的TabZIP1表达量均在-10℃时达到最高,且分蘖节中的表达量高于叶片;而JM22分蘖节中的TabZIP1表达量在0℃时达到峰值,叶片中的表达量却在-10℃达到最高。综合分析,DN1分蘖节中的TabZIP1表达量明显高于JM22。ABA处理后,DN1分蘖节中TabZIP1的表达量随温度的降低呈明显升高趋势,在-25℃时达到峰值。可见,ABA正调控TabZIP1的表达,有助于提高冬小麦的抗寒性。     

外源ABA对东农冬麦1号miRNA表达模式的影响

为鉴定ABA与小麦发育及抗寒性相关的MicroRNA(miRNA)表达和调控作用之间的关系,以东农冬麦1号为试材,对三叶期小麦幼苗喷施10-5 mol·L-1 ABA(剂量为1L·4m-2),分别于大田自然降温至4℃、0℃、-10℃和-25℃附近时取分蘖节,并对本室前期所获小RNA库中挑选的6条丰度较高且差异表达明显的miRNAs序列(miR165、miR166、miR319、miR5070、miR5139、miR3704)进行荧光定量PCR分析。结果表明,随着温度的降低,未经ABA处理的对照组样品中miR165、miR166、miR319、miR5139呈先升后降的变化趋势,miR5070呈升降升的趋势,miR3704呈上升趋势;而ABA处理的样品中miR165、miR166、miR5070、miR5139和miR3704表达量都呈降升降趋势,只有miR319呈先降后升的趋势,说明ABA改变了每条miRNA的表达模式。经ABA处理后的小麦样品中,各miRNA表达量与对照相比表现为4℃和-10℃时上调,0℃时下调,-25℃时除miR5070下调外其余miRNA上调,极低温度下的这种不同改变可能与miRNA靶基因的功能相关。     

小麦品种东农冬麦2号根中TaEXPA7部分同源基因的克隆及表达特性分析

膨胀素(expansin)是植物生长发育过程中诱导细胞壁松弛和伸展的蛋白,包括EXPA、EXPB、EXLA、EXLB四个基因家族,对植物根系的形成及快速发育具有重要作用。本试验以寒地冬小麦品种东农冬麦2号两叶一心期的根为材料,克隆了TaEXPA7基因的3个CDS全长,其氨基酸序列同源性较高,仅信号肽处有两个氨基酸不同,其核酸序列长度均为777bp,编码258个氨基酸,分别命名为TaEXPA7-A、TaEXPA7-B、TaEXPA7-D,且分别定位于2AL、2BL、2DL染色体。蛋白均含有DPBB-1和Pollen-allerg-1两个保守结构域,分子量为27 670.74Da,等电点为8.09,均为疏水性蛋白;与节节麦、二穗短柄草的相似性分别为99%和92%。采用两叶一心期的根进行qRT-PCR分析发现,TaEXPA7-A/B/D三个基因在根尖中的表达量均较高,伸长区和成熟区次之;对冬小麦根进行低温、干旱和激素处理后,这三个基因均下调表达,并且TaEXPA7-B基因的相对表达量较高,TaEXPA7-D的相对表达量较低。由此可见,多倍体小麦不同染色体上的基因在应对不同环境胁迫时,表达以及应答模式存在差异,并且在不同的环境胁迫下,发挥主导作用的染色体也存在差异;此外,该基因在根中的表达可能与低温、干旱以及外源激素的胁迫有一定的关系,可能是促进根系生长的重要基因。     

冬小麦东农冬麦1号miR5049-3p和miR1120a前体与靶基因的克隆及低温和ABA作用下的表达调控

为研究外源ABA对miRNA响应低温胁迫的影响,利用实验室已有的冬小麦品种东农冬麦1号miRNA库,通过生物信息学手段筛选出了与糖代谢相关差异表达的miR5049-3p和miR1120a,预测出其靶基因分别为 6PGL（6-磷酸葡糖酸内酯酶基因）和FBA（果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因）。生物信息学分析表明,两种miRNA的前体序列均能形成稳定的茎环结构,但其成熟体的碱基保守性较差,它们的启动子序列包含多种响应环境因子的顺式作用元件。经qRT-PCR分析,随着温度的降低,miR5049-3p和miR1120a分别与其靶基因呈负相关调控;外源ABA处理后,随着温度的降低,miR5049-3p和miR1120a的表达量皆呈“升-降-升”的趋势,其靶基因表达则相应明显降低,表明mi5049-3p和miR1120a可能分别负向调控靶基因 6PGL和FBA,进而介导糖代谢途径来响应低温胁迫。     

低温处理下东农冬麦1号小麦根组织EXPA基因的表达分析

寒地冬小麦膨胀素(Expansin)基因的表达特性同根系建成密切相关,而形成发达的根系是高寒地区冬小麦成功越冬返青的关键。为明确低温对高寒地区冬小麦膨胀素基因表达特性的影响,进而提高冬小麦对寒冷的适应性,以高抗寒冬小麦东农冬麦1号为试验材料,以正常冬小麦济麦22号为对照材料,运用实时荧光定量PCR技术对经不同低温处理的小麦幼苗根组织中编码α-expansin(EXPA)的基因TaEXPA5、TaEXPA6和TaEXPA7的表达特性进行分析。结果表明,在4℃、-10℃和-20℃低温处理下,高抗寒冬小麦东农冬麦1号中TaEXPA5、TaEXPA6和TaEXPA7基因的相对表达量与对照相比呈现显著性上升,其中,4℃处理条件下,TaEXPA6和TaEXPA7基因的相对表达量变化幅度较明显,-10℃处理条件下,TaEXPA5基因的相对表达量变化幅度较明显,-20℃处理条件下,TaEXPA5和TaEXPA7基因的相对表达量变化幅度较明显。说明低温影响小麦根组织中TaEXPA5、TaEXPA6和TaEXPA7基因的表达,三个基因与抗御低温胁迫具有相关性,并且各基因表达存在一定的协作性。     

干旱和复水条件下小麦叶片 TaNCED1表达与ABA积累的关系

NCED基因是ABA生物合成过程中的关键限速酶。为给小麦耐旱性研究及耐旱新品种选育提供理论依据,本研究以8个抗旱性不同的小麦品种为材料,研究干旱胁迫和复水过程中小麦叶片 TaNCED1表达水平和ABA含量对水分变化的响应。结果表明,在干旱胁迫过程中, TaNCED1的表达水平和ABA的积累呈现先增后降的变化趋势,品种间 TaNCED1的表达水平存在明显差异。济麦22、郑麦366等5个品种 TaNCED1的表达水平呈现明显的单峰曲线,而鲁麦21、临旱2号等3个品种呈现明显的双峰曲线,而且不同材料间 TaNCED1表达量达到最高值的时间也存在差异。在复水过程中,除临旱2号外,其余7个小麦材料的 TaNCED1表达均表现为先快速下降,之后缓慢上升的"V"字形变化趋势。整个水分胁迫和复水处理过程中,ABA含量的变化较为平缓,除临旱2号外, TaNCED1的相对表达量与ABA相对含量之间均都符合y=aln(x)+b的对数关系,且品种之间 TaNCED1对ABA的影响程度存在较明显的差异。分析认为,可以将 TaNCED1作为重要的水分胁迫响应基因应用于小麦抗旱育种和抗旱理论研究。     

低温下东农冬麦1号地下茎处差异蛋白的分析

为研究小麦品种的抗寒机理,以东农冬麦1号为材料,根据连续三年的冬小麦低温驯化及越冬期的气温资料,当小麦长至6叶期时,设定不同温度处理,分析不同温度下植株地下茎处蛋白质的变化.结果表明,4个降温处理中小麦植株地下茎处共有17个蛋白点发生显著变化.在这4次降温过程中重复出现的8蛋白点分别参与26 S蛋白水解途径、呼吸代谢、三羧酸循环、叶绿素合成,其中有一个位点是抗性蛋白.通过这8个蛋白点在不同温度下表达量的变化及蛋白点的功能对东农冬麦1号地下茎处抗寒性做了初步的推测.     

低温-干旱交叉胁迫对东农冬麦1号地下茎蛋白表达的影响

为给寒地冬小麦抗逆性的分子育种提供依据,采用蛋白质双向电泳及质谱技术,对不同低温-干旱交叉胁迫下抗寒品种东农冬麦1号地下茎的蛋白质表达进行了比较分析。结果表明,在pH 4~7范围内,在东农冬麦1号地下茎蛋白表达图谱中发现25个蛋白点在低温-干旱交叉作用下的表达量与单独低温胁迫下有明显差异,其中9个蛋白点在干旱-低温交叉作用下表达量上调,16个下调。对差异蛋白点进行质谱分析,并通过数据库检索进行蛋白质鉴定,得到完整的肽指纹图谱,其中逆境诱导蛋白占26%,代谢相关蛋白占38%。     

外源ABA对寒地冬小麦东农冬麦1号幼苗生长及抗冷性的影响

为给高寒地区冬小麦返青率的提高提供依据,以抗寒品种东农冬麦1号为试验材料,在添加ABA(浓度分别为0、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L)的琼脂(3%)培养基上暗培养(温度2～4℃,培养盒倾斜45°角),第11天分别调查胚芽和根系生长状况,研究了外源ABA对冬小麦幼苗生长及抗冷性的影响.结果表明,外源ABA对小麦的抗冷性有很大影响,低浓度的ABA可以促进低温下小麦的生长,提高其抗冷性,而高浓度则抑制生长.ABA提高小麦抗冷性的最适浓度为10-7mol/L.苗期低温下,ABA可以提高叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量,增加SOD活性,降低膜透性.根浸ABA对提高幼苗抗冷效果要强于叶喷ABA.     

小麦TaNIP4-1基因的克隆及生物信息学分析

水通道蛋白不仅控制着水分和一些小分子溶质的跨膜运输,也是植物体应对非生物胁迫的重要组成部分。为了进一步研究小麦水通道蛋白的功能,本研究以NCBI和Ensemble Plant数据库中查找出的已报道的小麦水通道蛋白基因序列为模板,针对其保守区设计了19对引物,应用PCR的方法从5个小麦品种中克隆出19个基因片段。通过比对鉴定到一个此前未曾报道的新基因,并对其进行生物信息学分析,将其命名为TaNIP4-1。理化特性分析表明,该基因位于3A染色体短臂,基因全长1 315bp,CDS序列长度864bp,含有3个外显子和2个内含子,编码含有288个氨基酸的多肽,含有保守的沙漏模型,有6个跨膜区和2个保守的NPA基序。亚细胞定位预测结果表明该基因位于质膜上。该基因启动子序列含有与逆境响应相关的顺式调控元件,而对7日龄的麦苗进行干旱和盐胁迫处理后,其qRT-PCR结果显示,干旱和盐处理5h后,TaNIP4-1基因在小麦叶片中的表达量明显上调;盐处理7d后,TaNIP4-1基因在小麦根部的表达量显著上调。由此可见,TaNIP4-1基因参与了小麦应对逆境的过程。     

油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦wcor413-like基因表达的影响

为探索低温胁迫下油菜素内酯(BR)对冬小麦分蘖节及叶片 wcor413-like基因表达的影响,以寒地冬小麦东农冬麦1号为试验材料,利用RT-PCR法克隆 wcor413-like基因的cDNA序列,用生物信息学法分析该序列的特征,用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测5℃、0℃、-10℃和-25℃四个温度处理下分蘖节和叶片中 wcor413-like基因的表达量。结果表明, wcor413-like基因含有一个629 bp的开放阅读框,可编码209个氨基酸,编码的wcor413-like蛋白为稳定蛋白质,主要分布在细胞质中。qRT-PCR分析表明,在叶片中, wcor413-like基因的表达量随着温度的降低呈现先上升后下降的变化趋势,-10℃时表达量最高;在分蘖节中, wcor413-like基因的表达量随着温度的降低呈持续上升的趋势,-25℃时表达量最高。BR处理后的叶片和分蘖节中, wcor413-like基因的表达量均在-25℃时达到最高,叶片中该基因的表达量显著高于对照组,而分蘖节中该基因的表达量显著低于对照组。推测BR可通过调控叶片和分蘖节中 wcor413-li...     

外源SA对低温胁迫下冬小麦糖酵解代谢的影响

为揭示SA处理对低温胁迫下冬小麦糖酵解(glycolysis, EMP)代谢的影响,以强抗寒性冬小麦品种东农冬麦1号(Dn1)和弱抗寒性品种济麦22号(Jm22)为试验材料,在小麦幼苗三叶期喷施1 mmol·L^-1 SA,于大田连续10 d自然降温至5、0、-10、-25℃时取小麦幼苗叶片和分蘖节,测定其果糖含量、丙酮酸含量及EMP代谢重要酶(己糖激酶HxK、磷酸果糖激酶PFK和丙酮酸激酶PK)的活性和相关基因(TaHxK、TaPFK、TaPK)的表达量。结果表明,SA处理提高了两种冬小麦叶片和分蘖节中果糖及丙酮酸含量,但对Jm22影响较弱;SA处理提高了Dn1叶片和分蘖节中EMP途径关键酶(HxK、PFK和PK)的活性及其相应基因(TaHxK、TaPFK、TaPK)的表达量。SA处理可有效调控冬小麦EMP代谢,促进果糖与丙酮酸积累与分解,提高植物的抗寒性。     

外源MeJA对低温胁迫下冬小麦冷响应基因表达的影响

为了探讨外源MeJA(茉莉酸甲酯)处理对低温胁迫下东农冬麦1号(Dn1)叶片和分蘖节中 TaICE41(CBF表达诱导因子)及4个冷响应基因( Wcor14、 Wcor15、 Wcor18、 Wcor413)表达量的影响,了解Dn1强抗寒性是否与JA(茉莉酸)对CBF途径冷响应基因的调节有关,以Dn1为试验材料,叶面喷施1mmol·L~(-1)MeJA,采用荧光定量PCR法检测低温(5℃、0℃、-10℃和-25℃)胁迫下Dn1叶片及分蘖节中 TaICE41及下游4个冷响应基因的表达量。结果表明,外源MeJA处理提高了低温胁迫下Dn1叶片及分蘖节中上述基因的表达量;-10℃下,Dn1分蘖节中 TaICE41、 Wcor14、 Wcor15、 Wcor18、 Wcor413表达量均达到最高值,处理组依次约为对照组的3.3倍、38.0倍、12.7倍、9.4倍、3.5倍,表明JA对CBF途径冷响应基因的调节与低温胁迫下Dn1的强抗寒性有关;-10℃是Dn1抗寒的重要温度节点,分蘖节是影响其越冬性的主要部位。生物信息学分析及预测表明, TaICE41位于3A染色体上,定位于细胞核内,表达产物为无规则卷曲型蛋白,属于HLH蛋白家族成员,与节节麦的ICE1蛋白亲缘关系最近。本研究可为解析激素JA调控植物抗寒性的分子机制提供理论依据。     

MeJA对低温胁迫下冬小麦抗寒生理及关键基因表达量的影响

植物激素作为一种信号分子,在植物响应低温胁迫中起重要作用。本研究以东农冬麦1号为材料,在田间三叶期用0.5、1.0和2.0 mmol·L~(-1) MeJA喷施小麦叶片,在大田自然降温条件下,探讨外源MeJA对其抗寒生理及 TaPDF1.2、 TaCOI1、 TaMYC2基因表达量的影响。结果表明,MeJA处理降低了低温胁迫下东农冬麦1号叶片及分蘖节的相对电导率和MDA含量,提高了脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的积累,提高了抗氧化酶SOD、POD和CAT活性;在不同处理浓度中,1.0 mmol·L~(-1) MeJA效果最好,处理后小麦返青率达91.5%;-10℃时,叶片和分蘖节内积累的保护性物质最多,保护性酶活性最强。东农冬麦1号分蘖节比叶片具有更强的抗寒性。此外,1.0 mmol·L~(-1)外源MeJA处理显著提高了东农冬麦1号叶片及分蘖节中 TaPDF1.2、 TaCOI1、 TaMYC2基因的表达量。     

冬小麦miR398前体的克隆及其在低温条件下对靶基因CSD1表达的调控

miR398是受逆境胁迫负调控的miRNA,其靶基因CSD编码超氧化物歧化酶(SOD),使植物抵御活性氧(ROS)的毒害。为进一步了解低温胁迫下miR398的调控机制,从东农冬麦1号中克隆小麦miR398前体,构建过表达载体并转化拟南芥,用Real-time PCR检测T0代植株中小麦miR398及其靶基因CSD1在低温胁迫下的表达量。结果表明,随着低温胁迫时间的延长,miR398表达下调、CSD1基因表达上调,认为小麦miR398能响应低温胁迫、负调控CSD1基因表达,间接提高了拟南芥的抗寒性。