黄瓜花叶病毒亚组研究进展

综述了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组研究的进展,根据寄主反应,血清学关系,病毒外壳蛋白肽链图谱分析,ｄｓＲＮＡ分析,核酸杂交,ＲＴ－ＰＣＲ产物酶解分析及核酸序列分析等方法,可将现有ＣＭＶ株系成分离物区分成２个亚组,尤其是利用单克隆抗体,核酸杂交、ＰＣＲ及核酸序列分析,能准确地将不同亚组的分离物区分开。从已知序列的ＣＭＶ株系分析,不同亚组株系的核苷酸序列同源率各ＲＮＡ组分仅为５８％￣７５％,同亚组株系的     

西瓜花叶病毒2号山西分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法，扩增获得西瓜花叶病毒２号（ＷＭＶ－２）山西分离物ＣＰ基因，并克隆到ｐＵＣ－Ｔ载体中，核苷酸序列测定结果表明，山西分离物ＣＰ基因全长为８４６个核苷酸，编码由２８１个氨基酸组成的３１．５ｋＤａ蛋白。与国外已报道的ＷＭＶ－２ＣＰ基因相比，其核苷酸序列同源性为９２．８％～９３．９％，由此推导的氨基酸序列同源性为９５．４％～９６．４％，山西分离物外壳蛋白有４个氨基酸残基明显不同于其它分     

云南烟草花叶病毒外壳蛋白基因的分离克隆及序列分析

从云南弥勒县采集典型病株接种蔓陀萝植斑分离,经免疫电镜（ＩＥＭ）鉴定为ＴＭＶ;在烤烟品种红花大金元上以ＴＭＶ普通株作对照进行致病率测定,确定为强毒株系,以烟草花叶病毒（ＴＭＶ）云南强毒株系ＲＮＡ为模板,根据国外研究结果,自行设计,合成寡核苷酸为引物,通过ＰＴ－ＰＣＲ体外扩增,得到约５００ｂｐ的ＤＮＡ片段,将其克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５０上,并进行了序列分析。分析表明,该基因含４７７个核苷酸,编码１５     

微量板杂交法和斑点杂交法检测菊花矮化类病毒的比较

利用狄高辛（ＤＩＧ）标记制备菊花矮化类病毒（ＣＳＶ）特异性探针，由反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）进行ＣＳＶ ＲＮＡ的反转录和ｃＤＮＡ的扩增，然后比较２种核酸杂交方法－微量板杂交和斑点杂交检测ＣＳＶ的灵敏度。本研究结果表明，３０ｍｇ干燥样本抽提的ＣＳＶ ＲＮＡ被稀释４００倍，取４μＬ（约７５０ｐｇ样本抽提的ＲＮＡ）经ＲＴ－ＰＣＲ，其产物再用１０×ＳＳＣ稀释１００倍，采用微量板杂交仍可很容易得到     

烟草花叶病毒蚕豆分离物移动蛋白基因克隆及序列分析

根据已报道的ＴＭＶ Ｕ１株系（ＴＭＶ－Ｕ１）的序列设计了特异性引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从烟 草花叶病毒蚕豆分离物（ＴＭＶ－Ｂ）上扩增移动蛋白（ＭＰ）基因及其邻近序列。将此ｃＤＮＡ片段克隆于 ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＳＫ质粒上,进行测序分析。结果表明：ＭＰ基因由８０７个核苷酸组成,编码２６８个氨基酸。与 ＴＭＶ－Ｕ１的ＭＰ基因序列比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为９９．０１％和 ９８．８９％。与ＴＭＶ－Ｙｕ的ＭＰ基因序列比较,同源性分别为９８．１４％和９８．８９％。说明ＴＭＶ的ＭＰ基因 在不同株系中是非常保守的。     

聚合酶链反应法进行Puumala病毒RNA扩增的研究

应用ＰＣＲ技术进行Ｐｕｕｍａｌａ病毒核酸片段的特异性扩增．将为进一步研究Ｐｕｕｍａｌａ病毒和相关病毒．以及检测此类病毒感染提供更加特异、敏感、快速的方法。依据已知的Ｐｕｕｍａｌａ病毒核酸序列，从Ｍ节段选出５对寡核苷酸作为ＰＣＲ反应中的引物，以Ｐｕｕｍａｌａ病毒ＲＮＡ作为模板。做ＰＣＲ。ＰＣＲ产物分别经凝胶电泳和核酸杂交的方法进行测定，结果表明。目的核酸片段得到了很好的扩增。     

烟草花叶病毒蚕豆分离物移动蛋白基因克隆及序列分析

根据已报道的ＴＭＶＵ１株系（ＴＭＶ－Ｕ１）的序列设计了特异性引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从烟草花叶病毒蚕豆分离物（ＴＭＶ－Ｂ）上扩增移动蛋白（ＭＰ＿基因及其邻近序列,将比ＣＤＮＡ片段克隆于ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒上,进行测序分析,结果表明ＭＰ基因由８０７个核苷酸组成,编码２６８个氨基酸,与ＴＭＶ－Ｕ１的ＭＰ基因序列比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性的９９．０１和９８．８９％,与ＴＭＶ     

双抗TMV和CMV转基因番茄后代的遗传分析

通过对转ＴＭＶ和ＣＭＶ双价外壳蛋白基因番茄Ｔ１代群体和Ｔ２代株系进行ＰＣＲ及ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ鉴定，并分别进行温室及田间抗病毒试验，结果表明，Ｔ１代工程番茄植株中确有ＣＭＶ—ＴＭＶ双价外壳蛋白基因的遗传和分离，其遗传行为符合显性单基因的孟德尔遗传。Ｔ２代部分株系ＣＭＶ—ＴＭＶ双价ＣＰ基因已获得稳定遗传，共获得了３个遗传稳定的番茄株系。     

番鸭细小病毒M91G27株VP3基因的克隆与序列测定

利用ＰＣＲ技术,从纯化番鸭细小病毒Ｍ９１Ｇ２７毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒结构多肽ＶＰ３基因。将该ＰＣＲ扩增片段克隆入ｐＵＣ１８质粒载体的ＨｉｎｃⅡ和ＳａｃⅠ位点之间,酶切分析筛选到含１．６ｋｂ基因片段的重组质粒ＭＰ１３。结果表明：该片段与国外已报道毒株核苷酸序列有９８．８％的同源性,氨基酸序列有９８．１％的同源性,证明该重组质粒是ＶＰ２基因的克隆。     

RV野毒株的鉴定,毒力实验及其核酸探针的研究

对从我国不同地区、不同动物分离的３个疑似狂犬病毒分离物８２０２、ＢＲＶ、ＭＲＶ和无毒疫苗株ＳＲＶ９进行了ＥＬＩＳＡ和核酸探针的鉴定。同时，对它们的致病性和毒力进行了测定。结果表明，３个分离物均为狂犬病病毒，其毒力以鼠源ＭＲＶ最强，牛源ＢＲＶ最弱，同地下同动物分离的ＢＲＶ和ＭＲＶ毒力差异很大。疫苗株ＳＲＶ９对１２ｇ小鼠无致病性，研制的狂犬病毒地高辛标记核酸探针敏感性高，特异性强，适用于对狂犬病病料进     

云南主要地区辣椒分离的黄瓜花叶病毒的亚组鉴定*

 在云南富民、砚山、邱北和南涧等云南主要辣椒产区采集了28个病毒样品,选择应用RT-PCR,Msp I以及EcoR I酶切和克隆测序等分子生物学手段对其中的7种进行检测。经过RT-PCR实验确定其病原为黄瓜花叶病毒（CMV）,同时分离物的Msp I酶切图谱与CMV亚组I的酶切图谱很相似,经EcoR I酶切后也没有出现异常差异。进一步对所检测的黄瓜花叶病毒分离物的外壳蛋白基因进行克隆测序,结果表明,分离物的核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组I的分离物的核苷酸序列有极高的同源性,达93%~98%; 而与亚组II株系的核苷酸序列同源性仅为77%。因此将所分离到的黄瓜花叶病毒分离物归属于黄瓜花叶病毒亚组I。     

浙江省地方鸡种禽白血病毒抗原检测与部分分离株GP85基因序列分析

为了解浙江地区地方品种鸡中J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis vrius,ALV-J)的感染情况与流行毒株的分子特征,对浙江省部分地方品种鸡体内ALV的p27抗原进行了检测,从疑似感染鸡群中检测分离到5株ALV-J,并对其GP85基因进行PCR分子克隆和序列分析。研究结果显示:在检测的19个地方鸡品系中,所有品系的鸡样本都呈现抗原阳性,其中101系的抗体阳性率最高,母鸡阳性率为40.48%,公鸡阳性率为16.54%;126系次之,母鸡阳性率为28.87%,公鸡阳性率为3.30%;171系抗体阳性率最低,其母鸡阳性率仅为4.08%,公鸡的感染率为0。为了解地方鸡群中ALV-J的遗传变异,对分离到的5株ALV-J的GP85基因进行了分子克隆和序列分析。结果表明,5个分离毒株的GP85基因大小均为924 bp,与预期一致;本研究样品序列之间的核苷酸同源性为90.8%～98.5%,与原型毒株HPRS103核苷酸相似性为90.3%～97.0%,与国内其他分离株的同源性为86.5%～99.0%。分离株与福建(FJ201308株)和广东(WF13株)分离株的同源性...     

猪圆环病毒2型厦门株-1的ORF2基因序列分析

根据猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,设计合成1对引物,对PCV2厦门株-1(XM-1)的ORF2基因进行PCR扩增.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可清晰看见1条与设计相符的大小为729 bp的特异条带.提取该片段进行测序,并与国内外24株PCV2毒株的ORF2进行比较,发现得到的PCV2 XM-1的ORF2与广西PCV2分离株(AY556475)核苷酸和氨基酸序列同源性均达到100%,与其它PCV2毒株ORF2的同源性分别为91.6%-99.9%和88.9%-100%,表明厦门地区生猪已感染PCV2,PCV2的ORF2基因与其它毒株有所不同.     

黄瓜花叶病毒西番莲分离物RNA3 的cDNA全长克隆和序列分析

采用RT-PCR方法克隆了黄瓜花叶病毒西番莲致死分离物（CMV-PE）全长RNA3.经核苷酸序列测定，明确PE分离物 RNA3全长2216 nt，含有2个开放阅读框（ORF），其中5'端的ORF（121-963 nt）编码279 aa的3a蛋白，3'端ORF（1260-1916 nt ）编码218 aa的CP蛋白.5'端非编码区（NR）长120 nt,基因间隔区（IR）长296 nt，3'端NR区含301个碱基.PE分离物编码的3a蛋白中最明显的特征是在136-141位有一个独特的VWCLSS区域.将CMV-PE的RNA3的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与同属CMV亚组I的其它分离物进行比较，发现症状相似的CMV分离物的非编码区具有很高的序列同源性，说明非编码区序列与症状有关.     

猪圆环病毒2型广东株全基因的克隆与序列分析

根据GenBank中发表的已知猪圆环病毒2型(Porcine Circovims-2,PCV-2)全基因序列,自行设计2对特异性引物,从2株接种疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning muhisystemic wasting syndrome,PMWS)仔猪病料的PK-15细胞中提取基因组DNA,以此为模板,用PCR方法分2段扩增2个PCV-2广东株(GZ株和ZS株)的全基因序列．应用序列分析软件DNAstar,对所测2组PCV-2序列与GenBank中的国内外PCV-2毒株进行同源性比较,并绘制系统进化发生树,进行了序列分析．结果表明,2个PCV-2广东株全基因组皆为1767bp,2个毒株间全基因序列核苷酸同源性为77．0％,第一开放阅读框(ORF1)间的核苷酸同源性仅为57．7％,而第二开放阅读框(ORF2)间的核苷酸同源性却高达99．1％．ZS株和GenBank中国内外其他的PCV-2参考毒株序列的核苷酸同源性在95．7％-99．5％之间;而GZ株和其他PCV-2参考毒株序列的核苷酸同源性仅在74．2％-77．1％之间．     

分子生物学方法在瘤胃微生物研究中的应用

文章综述了以16S rRNA序列分析技术为主的分子生物学技术在反刍动物瘤胃微生态研究中的应用现状,主要包括:序列分析技术、DGGE指纹技术、寡核苷酸探针杂交分析法以及定量PCR等分子生物学方法和技术。今后的发展趋势是加强这些方法间及其与传统方法的有机结合,并发展新的方法,促进瘤胃微生态研究的深入开展。     

Complete Genome Sequencing and Analysis of Rehmannia Mosaic Virus Isolate from Shanxi Province

Using double-stranded RNA(dsRNA) technology and sequence-independent amplification(SIA), the molecular identification on infected Rehmannia glutinosa in the field with mosaic symptoms was performed and the whole-genome of the Rehmannia mosaic virus(ReMV) Shanxi isolate(ReMV-SX) was sequenced. Sequencing analysis showed that the virus that infected Rehmannia glutinosa was Rehmannia mosaic virus(ReMV). The full-length of the obtained ReMV-SX sequence(GenBank accession no. JX575184) was 6 395 nt, containing four open reading frames(ORFs). The sequence homology analysis of the complete nucleotide sequence showed that ReMV-SX was 93.8%-97.0% homologous to ReMV in Tobamovirus subgroup I, while only 49.8%-58.9% homologous to the isolates in subgroups II and III of the same genus. Phylogenetic analysis showed that ReMV-SX and ReMV-Henan formed a separate branch and had the closest genetic relationship. The results laid the foundation for ongoing researches in the taxonomic status and evolution of ReMV and for further investigating the pathogenic mechanism of ReMV infecting Rehmannia glutinosa.     

黄瓜花叶病毒紫松果菊分离物外壳蛋白特性分析

以紫松果菊上分离的黄瓜花叶病毒2-1-2的RNA为模板,采用RT-PCR(反转录聚合酶链式反应,下同)技术对2-1-2的外壳蛋白(coat prote in,CP)基因进行了克隆和序列测定。该CP基因全长657个碱基,编码218个氨基酸。其核苷酸序列和推导的氨基酸序列与亚组I代表株系Fny的同源性分别为94.5%和98.1%,与亚组II代表株系Q的同源性分别为77.7%和82.5%。对包括该分离物在内的20个CP序列与地域之间的关系进行了分析,结果表明CMV不同分离物的亚组类型与地域无明显关系。     

7株猪圆环病毒2型福建分离株全基因组序列分析

根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,分段设计2对PCV2特异性引物,用PCR方法扩增近年从福建省部分发病猪场分离鉴定的7株PCV2的全基因序列并进行比对分析.结果表明:7株PCV2基因组全长1767 bp,与GenBank上发表的17株PCV2参考毒株的同源性为94.7%-99.5%;7株PCV2分离株之间的全基因同源性高达98.4%-99.5%;7株PCV2 ORF2编码蛋白均具有很强的亲水性和抗原性,其核苷酸及推导的氨基酸同源性高达98.9%-99.7%和97.9%-99.6%,与参考毒株的同源性分别为91.1%-99.7%和85%-100%,存在一定的差异.可见,7株PCV2在基因水平上差异不显著,在地域分布上也没有明显差异.     

鸡传染性支气管炎病毒腺胃分离株的分子鉴定

 从发病鸡场中收集的腺胃肿大病料(编号为2/97、3/97和1/98),经匀浆和无菌处理后在SPF鸡胚中传代、分离和鉴定。结果显示,接种病料培养的鸡胚可干扰新城疫病毒的复制;这些分离毒株可与阳性标准参考株IBV抗血清反应,但表现出较低的中和反应能力。在理化和血凝特性等鉴定的基础上,参照已发表的IBV Beaudette毒株S1基因序列,设计并合成1对含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的特异性引物,利用RT-PCR技术扩增到分离毒株3/97、2/97、1/98长度为1.93kb的cDNA片段,并将其cDNA片段插入到克隆载体pBlueScript-SK(+)中,进行核苷酸序列的测定,确证所扩增和克隆的cDNA片段由1930个碱基组成,并编码1条由620个氨基酸组成的多肽。与GenBank中其它IBV S1基因序列进行比较,发现3/97、2/97和1/98毒株与所比较的IBV毒株核苷酸的一致性为73.6％～99.7％,氨基酸的一致性为78.4％～99.7％。