近交对中间球海胆受精率、孵化率和幼体发育的影响

通过构建不同近交水平的海胆群组,即半同胞近交组(H组,F=0.125)、全同胞近交组(F组,F=0.25)和对照组(C组,F=0),研究了近交对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius受精、孵化和幼体发育阶段的影响。结果表明:近交对海胆的受精率、孵化率和四腕幼体的畸形率均无显著影响(P>0.05);不同近交水平的四腕、六腕和八腕幼体体长均表现为H组>C组>F组,体宽表现为无规律性;六腕幼体的胃长和胃宽均为F组>C组>H组,八腕幼体的胃长和胃宽均为C组>H组>F组。研究表明,一定近交水平(F=0.25)的中间球海胆的受精、孵化,以及变态前幼体的体长、体宽均没有出现明显的近交衰退,但幼体胃长和胃宽的近交衰退现象比较明显。     

中间球海胆、光棘球海胆自繁和杂交后代幼体发育及对高温的反应

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius ( Si)和光棘球海胆S. nudus ( Sn)进行完全双列杂交,通过对自繁后代(Si♀×Si♂、 Sn♀×Sn♂)和杂交子代(Si♀×Sn♂、 Sn♀×Si♂)的幼体发育进行观察,详细描述了幼体发育各个阶段的形态特征,并在18、22、26、30℃4个温度下对自繁和杂交子代的受精率、孵化率、各幼体时期的畸形率和生长状况进行了测量和分析。结果表明：杂交海胆的受精率均显著低于自繁海胆(P<0.05), Si♀×Sn♂杂交海胆在18℃时的孵化率与自繁海胆无显著性差异(P>0.05);Si♀×Sn♂杂交海胆幼体形态融合了两种自繁幼体的特征;温度对光棘球海胆自繁和杂交海胆子代的受精率、孵化率均有显著影响(P<0.05),中间球海胆在22℃下的受精率和孵化率最高,而光棘球海胆的最适受精和孵化温度为18℃, Si♀×Sn♂杂交海胆最适受精温度为22℃,而最适孵化温度为18℃;温度对海胆幼体发育的畸形率和生长均有显著影响( P<0.05),3种海胆幼体的最适生长水温均为18℃, Si♀× Sn♂杂交海胆在四腕幼体时期的畸形率最低,体长最小,除在八腕幼体时期畸形率最高外,在六腕幼体和八腕幼体时期的畸形率和生长性状均是介于自繁幼体之间。研究表明, Si♀×Sn♂杂交海胆在胚胎发育早期具有母本的热耐受性和生长劣势,但是随着幼体的生长发育,母性效应逐渐减弱,其在生长方面逐渐体现出父本的生长优势。     

中间球海胆、光棘球海胆自繁和杂交后代幼体发育及对高温的反应

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius(Si)和光棘球海胆S.nudus(Sn)进行完全双列杂交,通过对自繁后代(Si♀×Si♂、Sn♀×Sn♂)和杂交子代(Si♀×Sn♂、Sn♀×Si♂)的幼体发育进行观察,详细描述了幼体发育各个阶段的形态特征,并在18、22、26、30℃4个温度下对自繁和杂交子代的受精率、孵化率、各幼体时期的畸形率和生长状况进行了测量和分析。结果表明:杂交海胆的受精率均显著低于自繁海胆(P<0.05),Si♀×Sn♂杂交海胆在18℃时的孵化率与自繁海胆无显著性差异(P>0.05);Si♀×Sn♂杂交海胆幼体形态融合了两种自繁幼体的特征;温度对光棘球海胆自繁和杂交海胆子代的受精率、孵化率均有显著影响(P<0.05),中间球海胆在22℃下的受精率和孵化率最高,而光棘球海胆的最适受精和孵化温度为18℃,Si♀×Sn♂杂交海胆最适受精温度为22℃,而最适孵化温度为18℃;温度对海胆幼体发育的畸形率和生长均有显著影响(P<0.05),3种海胆幼体的最适生长水温均为18℃,Si♀×Sn♂杂交海胆在四腕幼体时期的畸形率最低,体长最小,除在八腕幼体时期畸形率最高外,在六腕幼体和八腕幼体时期的畸形率和生长性状均是介于自繁幼体之间。研究表明,Si♀×Sn♂杂交海胆在胚胎发育早期具有母本的热耐受性和生长劣势,但是随着幼体的生长发育,母性效应逐渐减弱,其在生长方面逐渐体现出父本的生长优势。     

中间球海胆幼体及稚海胆生长性状的遗传参数估计

为估计中间球海胆Strongylocentrotus intermedius幼体及稚海胆生长性状的遗传参数,采用巢式不平衡设计方法建立了44个中间球海胆全同胞家系,并测量了各家系海胆四腕幼体、六腕幼体和八腕幼体等各期浮游幼体的体长以及受精后30 d的稚海胆壳径,采用动物模型和约束性最大似然法(REML)估计了中间球海胆幼体和稚海胆生长性状的遗传参数。结果表明:中间球海胆四腕幼体和八腕幼体体长的遗传力分别为0.705±0.373和0.538±0.444,为高度遗传力,六腕幼体体长和稚海胆壳径的遗传力均接近于0,为低度遗传力;各阶段幼体体长和稚海胆壳径的共同环境效应为0.048⁰.352;各阶段幼体体长间遗传相关为正相关(0.3000.352;各阶段幼体体长间遗传相关为正相关(0.300⁰.518),各阶段幼体体长与稚海胆壳径间的遗传相关为负相关(-0.1520.518),各阶段幼体体长与稚海胆壳径间的遗传相关为负相关(-0.152^-0.435)。本研究结果可为制定中间球海胆的早期选择和间接选择选育方案提供参考依据。     

中间球海胆幼体及稚海胆生长性状的遗传参数估计

为估计中间球海胆Strongylocentrotus intermedius幼体及稚海胆生长性状的遗传参数,采用巢式不平衡设计方法建立了44个中间球海胆全同胞家系,并测量了各家系海胆四腕幼体、六腕幼体和八腕幼体等各期浮游幼体的体长以及受精后30 d的稚海胆壳径,采用动物模型和约束性最大似然法(REML)估计了中间球海胆幼体和稚海胆生长性状的遗传参数。结果表明:中间球海胆四腕幼体和八腕幼体体长的遗传力分别为0.705±0.373和0.538±0.444,为高度遗传力,六腕幼体体长和稚海胆壳径的遗传力均接近于0,为低度遗传力;各阶段幼体体长和稚海胆壳径的共同环境效应为0.048~0.352;各阶段幼体体长间遗传相关为正相关(0.300~0.518),各阶段幼体体长与稚海胆壳径间的遗传相关为负相关(-0.152~-0.435)。本研究结果可为制定中间球海胆的早期选择和间接选择选育方案提供参考依据。     

中间球海胆与紫海胆种间杂交的受精、孵化和幼体发育研究

为探明中间球海胆Strongylocentrotus intermedius(Si)与紫海胆Anthocidaris crassispina(Ac)种间杂交的受精、孵化和幼体发育规律,对中间球海胆和紫海胆进行种间杂交,检测了不同水温和精子种类对海胆受精卵卵径、受精率和孵化率的影响,并对自繁和杂交海胆幼体发育时间和体长进行了测定和比较。结果表明:受精前中间球海胆卵径(86.64μm±4.21μm)极显著小于紫海胆(95.62μm±3.80μm)(P<0.01);在21℃和24℃下,自交组Si♀×Si♂受精卵卵径显著或极显著大于杂交组Si♀×Ac♂(P<0.05或P<0.01),而杂交组Ac♀×Si♂和自交组Ac♀×Ac♂受精卵卵径则不受水温(24℃和26℃)的影响;相同温度下,种间杂交受精率均极显著低于自繁受精率(P<0.01),Si♀×Si♂组(或Si♀×Ac♂组)受精率在21℃和24℃下无显著性差异(P>0.05),而杂交组Ac♀×Si♂在26℃下的受精率极显著高于24℃下(分别为38.91%±8.25%和0.79%±1.11%)(P<0.01);杂交组Si♀×Ac♂在21℃下的孵化率(87.96%±4.18%)极显著低于自交组Si♀×Si♂(99.64%±0.81%)(P<0.01),而在24℃下,这两组海胆均不能孵化,杂交组Ac♀×Si♂在24℃下的孵化率(9.32%±4.33%)极显著低于自交组Ac♀×Ac♂(100%)(P<0.01),而在26℃下则不能孵化;Ac♀×Ac♂组和Ac♀×Si♂组在24℃下经5 d即可发育至八腕幼体,Si♀×Ac♂组在21℃下经9 d发育至八腕幼体,Si♀×Si♂在21℃下经12 d发育至八腕幼体。研究表明,杂交组Si♀×Ac♂适宜在24℃下受精,21℃下孵化,而杂交组Ac♀×Si♂则适宜在26℃下受精,24℃下孵化,杂交组Ac♀×Si♂可能更具备高温耐受能力,可作为耐高温品种培育的重点材料进行进一步研究。     

中间球海胆与紫海胆种间杂交的受精、孵化和幼体发育研究

为探明中间球海胆Strongylocentrotus intermedius(Si)与紫海胆Anthocidaris crassispina(Ac)种间杂交的受精、孵化和幼体发育规律,对中间球海胆和紫海胆进行种间杂交,检测了不同水温和精子种类对海胆受精卵卵径、受精率和孵化率的影响,并对自繁和杂交海胆幼体发育时间和体长进行了测定和比较。结果表明:受精前中间球海胆卵径(86.64μm±4.21μm)极显著小于紫海胆(95.62μm±3.80μm)(P<0.01);在21℃和24℃下,自交组Si♀×Si♂受精卵卵径显著或极显著大于杂交组Si♀×Ac♂(P<0.05或P<0.01),而杂交组Ac♀×Si♂和自交组Ac♀×Ac♂受精卵卵径则不受水温(24℃和26℃)的影响;相同温度下,种间杂交受精率均极显著低于自繁受精率(P<0.01),Si♀×Si♂组(或Si♀×Ac♂组)受精率在21℃和24℃下无显著性差异(P>0.05),而杂交组Ac♀×Si♂在26℃下的受精率极显著高于24℃下(分别为38.91%±8.25%和0.79%±1.11%)(P<0.01);杂交组Si♀×Ac♂在21℃下的孵化率(87.96%±4.18%)极显著低于自交组Si♀×Si♂(99.64%±0.81%)(P<0.01),而在24℃下,这两组海胆均不能孵化,杂交组Ac♀×Si♂在24℃下的孵化率(9.32%±4.33%)极显著低于自交组Ac♀×Ac♂(100%)(P<0.01),而在26℃下则不能孵化;Ac♀×Ac♂组和Ac♀×Si♂组在24℃下经5 d即可发育至八腕幼体,Si♀×Ac♂组在21℃下经9 d发育至八腕幼体,Si♀×Si♂在21℃下经12 d发育至八腕幼体。研究表明,杂交组Si♀×Ac♂适宜在24℃下受精,21℃下孵化,而杂交组Ac♀×Si♂则适宜在26℃下受精,24℃下孵化,杂交组Ac♀×Si♂可能更具备高温耐受能力,可作为耐高温品种培育的重点材料进行进一步研究。     

雌二醇对中间球海胆生长、性腺发育及胆固醇代谢的影响

为探讨雌二醇(estradiol)对体质量为(13.58±0.79)g的中间球海胆Strongylocentrotus intermedius性腺发育的调控机制,在室内水槽(200 L)中进行为期60 d的注射试验。试验分对照组、雌二醇(5μg/m L)注射组和他莫昔芬(tamoxifen)(25μg/m L)注射组,每3 d注射1次,并于第30天和第60天时两次取样测定海胆增重率(WGR)、性腺指数(GSI)、性类固醇激素含量和胆固醇合成相关基因的表达量。结果表明:注射雌二醇或他莫昔芬并未显著影响海胆的生长速率,却显著影响试验末期海胆的性腺指数,雌二醇组海胆性腺指数显著高于对照组和他莫昔芬组(P0.05);试验结束时,雌二醇组和他莫昔芬组海胆体腔液中雌二醇含量和性腺中胆固醇含量均显著高于对照组(P0.05),雌二醇组海胆性腺中雌二醇含量最高,显著高于对照组和他莫昔芬组(P0.05);雌二醇组海胆性腺和消化道中主要卵黄蛋白(MYP)基因均高于对照组,但均未有显著性差异(P0.05);雌二醇组和他莫昔芬组海胆性腺和消化道中性类固醇激素合成关键基因CYP17和胆固醇合成关键基因CYP51表达量均显著高于对照组(P0.05);他莫昔芬组海胆性腺中CYP17和CYP51基因表达量均低于雌二醇组(P0.05)。研究表明,注射雌二醇显著提高了中间球海胆性腺指数、体内雌二醇含量和雌二醇合成相关基因的表达量,这可能是雌二醇促进海胆性腺发育的调控机制。     

雌二醇对中间球海胆生长、性腺发育及胆固醇代谢的影响

为探讨雌二醇(estradiol)对体质量为(13.58±0.79)g的中间球海胆Strongylocentrotus intermedius性腺发育的调控机制,在室内水槽(200 L)中进行为期60 d的注射试验。试验分对照组、雌二醇(5μg/m L)注射组和他莫昔芬(tamoxifen)(25μg/m L)注射组,每3 d注射1次,并于第30天和第60天时两次取样测定海胆增重率(WGR)、性腺指数(GSI)、性类固醇激素含量和胆固醇合成相关基因的表达量。结果表明:注射雌二醇或他莫昔芬并未显著影响海胆的生长速率,却显著影响试验末期海胆的性腺指数,雌二醇组海胆性腺指数显著高于对照组和他莫昔芬组(P<0.05);试验结束时,雌二醇组和他莫昔芬组海胆体腔液中雌二醇含量和性腺中胆固醇含量均显著高于对照组(P<0.05),雌二醇组海胆性腺中雌二醇含量最高,显著高于对照组和他莫昔芬组(P<0.05);雌二醇组海胆性腺和消化道中主要卵黄蛋白(MYP)基因均高于对照组,但均未有显著性差异(P>0.05);雌二醇组和他莫昔芬组海胆性腺和消化道中性类固醇激素合成关键基因CYP17和胆固醇合成关键基因CYP51表达量均显著高于对照组(P<0.05);他莫昔芬组海胆性腺中CYP17和CYP51基因表达量均低于雌二醇组(P>0.05)。研究表明,注射雌二醇显著提高了中间球海胆性腺指数、体内雌二醇含量和雌二醇合成相关基因的表达量,这可能是雌二醇促进海胆性腺发育的调控机制。     

饥饿和再投喂对中间球海胆性腺发育的影响

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius进行了不同时间的饥饿和再投喂试验。采用各组“饥饿时间 投喂时间”相同的试验设计,在30 d内,试验组(S3、S6、S9、S12组)海胆分别饥饿3、6、9和12d后再连续饱食投喂直至试验结束,同时设对照组S0。结果表明:试验结束时S3组海胆性腺重、性腺指数均接近对照组,其余各组较对照组低;特殊生长率在再投喂的第2 d或第4 d出现最大值。性腺组织学观察的结果表明:对照组海胆性腺为滤泡型,由生殖细胞和营养细胞构成,发育至生长期;随着饥饿时间的延长,雄海胆性腺中成熟精子的数量减少,雌海胆性腺中初级卵母细胞发育迟缓,而雌、雄海胆性腺中营养细胞的数量无明显变化;再投喂后,性腺有不同程度的发育。     

中间球海胆性别性状的微卫星分析

针对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius育苗生产中很难进行活体性别鉴定这一特点,采用组织切片法和微卫星标记分析法对海胆进行观察分析。试验用样品由大连太平洋海珍品有限公司提供,共31只。采用组织切片法鉴别雌、雄个体,发现17只个体为雌性,14只个体为雄性。同时,将31只个体分为雌、雄两个群体,提取性腺组织基因组DNA,利用已经筛选好的11对引物对雌、雄两个群体进行微卫星分析。结果表明,两个群体的遗传多样性没有显著差异;发现INST09-A,INST10-A,INST10-B三个等位基因的频率在两个群体间存在极显著差异(P<0.01),位点INST10在雌、雄两个群体中的基因型频率存在极显著差异(P<0.01)。初步说明这些位点及相应等位基因可能与性别决定位点存在一定的连锁关系。     

镉对中间球海胆精子发生的影响

研究了不同浓度镉离子(0.005、0.1、0.5、1.0 mg/L)对中间球海胆Strongylocentrotus interm edius精子发生的影响。结果显示:在光镜下观察,染毒第6、18 d后,各浓度组中间球海胆滤泡结构完好,生殖细胞发育情况同对照组基本一样;染毒第42 d后,0.5、1.0 mg/L Cd2 浓度组生精细胞排列混乱,滤泡膜破损;染毒第54 d后,各浓度组海胆性腺均出现滤泡解体现象。对染Cd2 54 d的0.5、1.0 mg/L组海胆精巢进行超薄切片观察,可见各级生精细胞亚显微结构变化明显,主要表现为核染色质异常凝集,核膜结构损伤,线粒体空泡化,精子形态畸形等。说明镉能影响中间球海胆的精子发生,导致精子质量下降。     

中间球海胆雌核发育单倍体胚胎的初步研究

采用不同剂量(30～330mJ／cm^2)的紫外线对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子进行照射失活,获得了雌核发育的单倍体胚胎。测定了照射组与对照组的受精率、单倍体诱导率、2～4细胞期的畸形率和破膜囊胚成活率,探明了精子灭活的紫外线适宜剂量为270mJ／cm^2;并进行了早期胚胎地衣红压片观察和早期囊胚染色体数分析,观察到照射组早期胚胎的精核具有DCB小体,对照组早期囊胚的染色体数为2n=42,照射组雌核发育单倍体胚胎的染色体数为n=21。     

海洋酸化和升温对中间球海胆幼虫发育和生长的影响

为了研究海洋酸化和气候变暖对海洋生物的联合作用,按照文献[4]和[7]中对海洋环境变化的预测趋势,设置了3组海水,即对照组(pH为7.93～7.99,水温T为18℃)、试验组E3(在对照组基础上pH减小0.3,T升高3℃)、试验组E6(在对照组基础上pH减小0.6,T升高6℃),在此条件下对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius幼虫的发育及生长情况进行了研究。结果表明:酸化及升温海水对海胆孵化率没有显著影响;E3组海胆与对照组发育进程一致,而E6组则较慢;E3和E6组海胆分别存活了18 d和12 d,分别发育至八腕幼虫和四腕幼虫阶段,可见试验海水环境严重影响海胆幼虫的存活;E3组海胆幼虫的生长在受精后的前10 d与对照组差异不显著(P>0.05),之后显著低于对照组(P<0.05),而E6组海胆幼虫的生长在整个试验阶段均显著低于对照组(P<0.05);将骨针长度分解为口后腕骨针长度和躯干部骨针长度,各组海胆的生长差异主要表现在口后腕骨针长度上;试验组长腕幼虫畸形均不同程度地表现为腕短小、萎缩、腕骨针折断、骨针弯曲变形等。研究表明,中间球海胆对海洋酸化和气候变暖的海洋环境非常敏感,如果按照预测趋势,海洋环境变化将会对该海胆产生严重的负面影响。     

中间球海胆精子超低温冷冻损伤的研究

应用透射电镜技术研究了超低温冷冻保存对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子超微结构的影响。结果表明：不加抗冻剂的情况下,精子线粒体和顶体结构不完整,质膜、鞭毛破损。加入保护剂后,多数精子结构完好,部分精子细胞器受损,表现为质膜褶皱或膨胀举起,与核膜的间隙明显增大;顶体肿胀、破裂或脱落;线粒体嵴间隙增大,内部出现空泡,甚至线粒体内膜破损,内嵴减少,呈弥散状;鞭毛被膜肿胀,呈波浪状,＂9＋2＂型结构模糊;细胞核结构没有明显变化。应用单细胞凝胶电泳技术研究了精子冷冻保存前后DNA的损伤。结果表明,不加抗冻剂的冷冻组及添加抗冻剂的试验组精子DNA损伤情况与鲜精相比均无显著差异（P〉0.05）,冷冻对精子结构的损伤是造成精子活力及受精率下降的主要原因。     

中间球海胆精子超低温冷冻保存方法的研究

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子的超低温保存技术进行了研究。以煮沸消毒海水为基础液,添加体积分数为10%的DMSO、体积分数为6%的甘油以及25 mmol/L海藻糖配制成冷冻保护液,与鲜精液按体积比以1∶1混合,在4℃下平衡15 min,于液氮面上方15、3 cm处分别停留3 min和5 min,然后浸入液氮保存。结果表明：用此方法保存的精子解冻后其存活率可达58.2%,受精率达24.7%;解冻后精子受精时,在受精海水中分别添加0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖,56 mmol/L组的受精率高于其他组,受精率达26%;精子解冻后受精时,在受精海水中添加适量葡萄糖有助于提高受精率。本试验表明,冷冻过程中降温方式、冷冻保护液、平衡时间对精子的冷冻保存效果均有较大影响,各个因素通过优化组合可以大大提高解冻后精子的存活率和受精率。     

虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析

采用同源克隆和cDNA末端快速扩增（ RACE）技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotus in-termedius TLR基因的全长cDNA序列SiTLR-1（GenBank： HQ259110）,并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌Vibrio fortis、β-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明： SiTLR-1全长序列为3637 bp,形成16个α螺旋、33个β折叠; SiTLR-1蛋白有两个跨膜区段,在725-750位有跨膜区,发现1个信号肽（1-32aa）、1个亮氨酸重复富集区（LRR）; SiTLR-1在检测的各组织中均有表达,在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌（ P〈0.05）;经V. fortis、β-D-葡聚糖刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达量显著上升,刺激后12 h达到最高值;经dsRNA刺激后,体腔液中的SiTLR-1表达变化较小,仅在3 h 时略有升高。研究表明, TLR 基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答,克隆获得的SiTLR-1可特异性识别细菌和β-D-葡聚糖。     

饥饿和再投喂对中间球海胆代谢和生长的影响

将体质量为（5．72±0．23）g的中间球海胆Strongylocentrotusintermedius分别饥饿0、3、6、9、12d（分别记为c、s3、s6、S9、S12）后再饱食投喂至30d,研究了饥饿与再投喂过程中海胆的代谢率、生长率、摄食率、食物转化率的变化。结果表明：在饥饿和再投喂过程中,s3组各指标与对照组无明显差异;s6、s9、S12组在恢复投喂过程中的一段时间内代谢率均维持较低水平,而特定生长率和食物转化率均在恢复投喂初期出现高峰。这说明S6、s9、S123个试验组海胆出现了部分补偿生长现象,这种补偿生长是再投喂后海胆通过降低代谢率及提高食物转化率来实现的。