D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白结构及抗原表位分析

利用生物软件对D型产气荚膜梭菌ε毒素的蛋白结构、抗原表位进行预测与分析。综合ε毒素蛋白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果显示,肽链13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位可能存在B细胞抗原表位,三级结构预测的94、151结合位点位于94-97、151-153抗原表位区内。     

IPTG诱导剂对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对已构建的含β2毒素基因重组质粒p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测不同培养条件下β2毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实,p ETXB2重组质粒含有β2毒素基因而且阅读框架和基因序列正确。同时采用IPTG诱导剂在改变培养基的p H、培养温度、诱导剂的加入量及诱导时间4个方面对β2毒素基因表达进行调控,其最佳的表达条件是37℃,p H 7.0的培养基中,用终浓度为0.8 mmol/L IPTG诱导4 h,β2毒素蛋白的表达效果最好。     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的测定与分析

[目的]研究C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的遗传变异特点。[方法]设计产气荚膜梭菌α毒素基因特异性引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后测定核苷酸序列并与NCBI登录的参考序列通过DNAStar软件进行同源比对。[结果]序列分析表明,所测菌株α毒素基因核苷酸组成中腺苷酸含量较高,胞苷酸含量较低。所测菌株与13、C57-1、CER 89L43、S01、S08、T01以及T16菌株的核苷酸序列同源性分别为98.7%、98.7%、98.6%、98.8%、98.7%、97.0%、98.6%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.6%、98.6%、98.9%、98.9%、98.9%、98.6%、98.6%。[结论]所测C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考序列同源性均较高。     

SDS-PAGE法检测产气荚膜梭菌毒素型研究

为了探索一种快速、准确检测产气荚膜梭菌毒素型的方法,以便有效预防控制该病的流行和发生,利用SDS-PAGE方法,对通过ELISA鉴定的20株(A型16株、C型3株和D型1株)德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株,以及通过Multiplex-PCR鉴定的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株外毒素蛋白的相对分子质量进行测定,以确定毒素的种类,进而确定菌株的毒素型。结果表明,产气荚膜梭菌标准株、德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株、山东省疫区产气荚膜梭菌分离株粗提外毒素的质量浓度分别为3.261,2.238~3.333,1.451~3.109mg/mL,精提外毒素的质量浓度分别为0.803,0.521~0.999,0.530~0.812 mg/mL。SDS-PAGE法检测的20株德国牛舍环境气源性产气荚膜梭菌分离株中A型17株、C型2株、D型1株,与ELISA检测结果的符合率为95.0%;SDS-PAGE检测的57株山东省疫区产气荚膜梭菌分离株全部是A型,与Multiplex-PCR检测结果的符合率为100%。说明应用SDS-PAGE方法对产气荚膜梭菌的检测结果与ELISA方法的检测结果有一定的差异性,与Multi-plex-PCR方法的检测结果一致。     

产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法。【方法】将原核表达重组质粒pET-28a-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行Western blot鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA试验条件,建立其抗体间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察,并用其对521份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性,获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ELISA条件为:抗原最佳包被质量浓度为5.0μg/mL,阳/阴性血清最佳稀释度为1∶50,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 500,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃封闭1h,抗原抗体作用1h,TMB显色30min。间接ELISA的判定标准为OD450≥0.313为阳性,OD4500.313为阴性;建立的间接ELISA方法的特异性为96%,敏感性为98%;批内变异系数在3%~4%,批间变异系数在9%以下。利用间接ELISA检测方法对521份临床山羊血清样本的检测结果表明,抗体阳性率为72.5%。【结论】对产气荚膜梭菌β毒素进行了原核表达,成功建立了其抗体间接ELISA检测方法,为产气荚膜梭菌β毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

产气荚膜梭菌能引起人类食物中毒和出血性肠炎,严重时可导致死亡。α毒素是A型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学角度对该毒素进行研究具有重要意义。对α毒素的分子生物学结构和致病机理进行了简要概述,并介绍了国内外对产气荚膜梭菌α毒素的检测方法和防治措施,以期为研究产气荚膜梭菌α毒素的致病机理以及预防和治疗动物气性坏疽、肠道出血症奠定基础。     

猪C型产气荚膜梭菌的分离与鉴定

为了摸清引起湖北某猪场3日龄内仔猪以出血性下痢、死亡率高的疾病病因,经病料涂片镜检、培养基接种、生化试验和血清型鉴定,诊断为C型产气荚膜梭菌感染,该菌厌气肉肝汤培养物上清0.001 m L可引起小鼠全部死亡,具有较强的毒力。     

羊源C型产气荚膜梭菌的分离鉴定、药敏试验及免疫治疗

从陕北某绵羊养殖场猝死绵羊的肝脏和脾脏中分离得到1株细菌,通过细菌培养特性、菌体形态、菌落特征、染色特性、生化试验、外毒素测定、毒素类型的PCR检测和药敏试验等鉴定,结果表明,该分离菌为革兰氏阳性大杆菌,生长特性和生化试验结果符合产气荚膜梭菌的所有特点;该菌可产生致小白鼠死亡的外毒素,PCR检测结果证实外毒素为α毒素和β毒素;药敏试验结果表明,该菌对环丙沙星、诺氟沙星等抗生素高度敏感,对庆大霉素、卡那霉素等抗生素不敏感。表明该菌为引起绵羊猝狙的C型产气荚膜梭菌,用羊梭菌疫苗紧急免疫羊群并配合应用抗生素治疗能有效控制该病的流行。     

表面展示C型产气荚膜梭菌α,β毒素蛋白重组乳酸菌的 构建及反应原性分析

构建表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白的重组乳酸菌,并对表达蛋白反应原性进行鉴定。通过PCR构建pSIP409-pgsA’-α,pSIP409-pgsA’-β1以及pSIP409-pgsA’-β2质粒,并将三种质粒电转入植物乳杆菌NC8后诱导表达,通过Western-blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。构建的NC8-pSIP409-pgsA’-α,NC8-pSIP409-pgsA’-β1以及NC8-p SIP 409-pgsA’-β2三种重组乳酸菌能成功表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白,三种表达的融合蛋白大小分别为61 kDa、52 kDa以及46 kDa。三种重组乳酸菌表达了C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白且与制备的多抗具有良好的反应原性,为C型产气荚膜梭菌口服疫苗的研制奠定基础。     

产气荚膜梭菌毒素型菌落多重PCR方法的建立及应用

根据产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因cpa、cpb、etx、iA设计并合成4对特异性引物,建立快速鉴定产气荚膜梭菌毒素型的多重PCR方法。结果显示:产气荚膜梭菌A、B、C、D和E型参考菌株均扩增出相应的片段,而肉毒梭菌、气肿疽梭菌、腐败梭菌、诺维梭菌的扩增均为阴性;将产气荚膜菌株单个菌落稀释100倍,仍能扩增出相应的目的片段。利用此多重PCR方法对16株不同动物来源的产气荚膜梭菌进行分型鉴定,并与毒素中和试验鉴定结果进行比较,结果显示2种方法具有较高的符合率。该方法可有效进行产气荚膜梭菌的快速检测和分型,对产气荚膜梭菌感染与食品安全问题的研究具有参考价值。     

D型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素遗传变异分析

研究D型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)青海分离株ε毒素基因的遗传变异特点,试验设计特异性引物扩增ε毒素基因,目的基因片段大小为888 bp.建立PCR反应体系并设置反应条件,扩增产物进行电泳检测、纯化、测定核苷酸序列,与参考序列进行同源比对分析.结果表明,目的基因扩增良好,分离菌株WC-epsilon-FL与菌株C60-3、NCTC 8346、Mukteshwar、AJ250956的核苷酸序列的同源性依次为99.9％、99.8％、98.9％、99.4％.     

B型产气荚膜梭菌三种主要毒素基因的PCR检测

为了对B型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type B)进行快速检测,依据NCBI登录的产气荚膜梭菌α、B及ε毒素基因序列设计引物,并对其进行PCR扩增.琼脂糖凝胶电泳结果显示3个毒素基因均被成功扩增,目标片段条带清晰,长度与预期相符.     

牛产气荚膜梭菌分离株毒素基因的检测与分析

为了解黑龙江省牛源产气荚膜梭菌分离株的基因型,检测β2和CPE两种次要毒素因子在牛源产气荚膜梭菌分离株中的携带情况。通过PCR方法检测了产气荚膜梭菌13个野毒株的cpa、cpb、etx、itx四种分型毒素、cpb2、cpb2的两个等位基因突变体(atypical cpb2和consensus cpb2)及肠毒素(cpe)基因。结果表明:92.3%(12/13)的产气荚膜梭菌分离株为A型,检测到1株D型;A型菌中β2毒素基因检出率为66.7%(8/12);β2毒素基因阳性菌株中75%(6/8)携带非典型cpb2基因,50%(4/8)携带典型cpb2基因,非典型突变体占优势。动物致病性试验发现β2毒素阳性菌株(8株)与β2毒素基因阴性菌株(4株)各有2株分离株具有致病性。所有菌株CPE毒素基因PCR检测均为阴性。研究为产气荚膜梭菌病的发病机理和疫苗开发提供了理论依据。     

C型产气荚膜梭菌不同菌株交叉免疫保护力研究

将C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)C59-2、C59-37和C59-383种菌株分别制备成灭活疫苗,分别免疫小白鼠和家兔,2周后分别用不同菌株的致死性毒素进行攻击。结果表明,C型产气荚膜梭菌不同菌株制备的灭活疫苗免疫小白鼠和家兔后,可使小白鼠和家兔能抵抗其他菌株致死性毒素的攻击,小白鼠保护数在7/8以上,家兔保护数也均在3/4以上。说明C型产气荚膜梭菌不同菌株之间具有较好的交叉免疫保护作用。     

A型产气荚膜梭菌α毒素的基因扩增和提纯鉴定

为了对A型产气荚膜梭菌α毒素快速准确地做出检测,本实验利用厌氧肉肝汤培养A型产气荚膜梭菌,经革兰染色观察以及含铁牛奶培养基观察其生化特性.然后使用饱和度为60％的硫酸铵粗提其α毒素蛋白,进行透析纯化并应用SDS - PAGE方法鉴定A型产气荚膜梭菌的α毒素,鉴定之后将纯化的α毒素给小鼠腹腔注射来检测其活性.结果表明,厌氧肉肝汤培养基变浑浊且产生大量气体,含铁牛奶培养基发生爆烈发酵现象,SDS - PAGE检测结果,α毒素分子量为43.6kDa,小白鼠出现梭菌病的典型临床症状.本实验为α毒素的鉴定及大量快速提取提供了一种参考方法,为进一步开展梭菌毒素的致病机理及制备类毒素疫苗奠定重要的实验基础.     

冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素的潜在危害分析

为调查广州市冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素危害,从广州市各大型超市随机采集鸡肉样品进行产气荚膜梭菌分离、鉴定和毒素分型,同时检测分离菌株对常用抗生素的抗药性,并采用Eric-PCR对分离出梭菌进行亚型分析。结果表明,从78个样本中分离出57株产气荚膜梭菌,所有菌株均为A型,其中,cpb2(Atypical)型40株,cpb2(consensus)型1株;含net B基因菌株1株;药敏结果显示,分离出的产气荚膜梭菌大部分对氟苯尼考、氨苄西林、青霉素敏感;值得注意的是产气荚膜梭菌分离株对仅可用于人的抗生素克林霉素、头孢氨卞的耐药率分别达73.68%和31.58%。Eric-PCR结果显示,相似性为80%时,57株梭菌可分为13个亚型,提示污染来源的多样性。     

D 型产气荚膜梭菌贵州分离株ε毒素的 DNA 序列测定与分析

为研究产气荚膜梭菌ε毒素的结构与功能,以及对该病的防治提供基础依据,利用 D 型产气荚膜梭菌贵州分离株（CP02株）,根据 GenBank 中登记的产气荚膜梭菌ε毒素基因设计特异性引物进行PCR 扩增,扩增产物纯化后测定核苷酸序列并与 NCBI 登录的参考毒株进行相似性比较。结果表明：D 型产气荚膜梭菌 CP02株基因片段大小为456 bp,与 CWD_CN_409、NCTC_8533、NCTN_6121、ETX21512、KurCpD1、CtrCpD2、IVRI_Vac1和 IVRI_49菌株的核苷酸序列相似性在98．5％～100％,推导的氨基酸序列相似性在98．4％～100％。碱基突变以 A-G、C-T 间的转换为主,也发生低频率的 A-C、G-T 间颠换,但突变均为点突变。     

多种动物源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性

【目的】研究猪源及其它动物源A型产气荚膜梭菌(CpA)的β2毒素基因和相关生物学特性。【方法】从南昌周边地区随机采集猪、牛、羊、鸡、犬、鱼的新鲜粪便样品,采用4%D-环丝氨酸FTG梭菌选择培养基从各样品中分离纯化产气荚膜梭菌,并对分离菌株进行培养特性观察、革兰氏染色镜检、生化鉴定和16S rDNA分子鉴定;再通过多重PCR技术进行分子分型,对分离到的A型产气荚膜梭菌(CpA)进行β2毒素基因检测和溶血试验。【结果】所分离到的CpA中,除犬源CpA,其它动物源分离株均携带β2毒素基因;不同动物源的CpA溶血时间和溶血强度不一样:羊源CpA在血平板上4 h能观察到明显的溶血,溶血圈直径达到30 mm;猪源CpA 6 h才能观察到明显的溶血,溶血圈直径约为14 mm。【结论】为了解CpA致病机理,解析其在不同动物致病强弱和地区特异性提供参考依据。     

C型产气荚膜梭菌α、β1、β2毒素基因融合及免疫原性研究

为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXAl中扩增出0.95 kb α毒素基因,将其连接到经Nco I单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kb β1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kb α-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实.构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导荆诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基PH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol.L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株.