豆豉芽孢杆菌原生质体形成及再生条件的初步研究

为选育出适宜于工业生产豆豉的重组菌株,对4株豆豉芽孢杆菌原生质体形成与再生条件进行了初步研究。结果表明:溶菌酶浓度、酶解时间和温度与原生质体的形成率成正相关,与再生率成负相关。不同菌株对溶菌酶的敏感度不同,适宜形成原生质体的酶浓度为0.05~0.50 mg/mL,酶解时间5~20 min,酶解温度35℃,原生质体形成率达90%,原生质体再生率为8%左右。     

种间杂交选育新型产脂蛹虫草

为选育能够合成虫草素又能高效积累油脂的新型蛹虫草菌株,将高产虫草素的蛹虫草FY1421及高效合成油脂特别是不饱和脂肪酸的深黄被孢霉菌株Z0108进行原生质体融合。对亲本的原生质体的形成与再生、双亲灭活及融合的条件进行了筛选与优化,并结合96微孔板初筛和摇瓶发酵复筛,获取融合子。结果表明:蛹虫草菌株FY1421采用1. 5%溶壁酶+0. 5%蜗牛酶+0. 5%纤维素酶的混合酶液处理120 min,原生质体数量最多,再生率最高;深黄被孢霉菌株Z0108采用1%溶壁酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶的混合酶液处理4 h,原生质体数量最多,再生率最高; FY1421原生质体采用60℃水浴热灭活10 min,Z0108原生质体采用紫外线灭活30 s,均可达到100%的灭活率;灭活双亲在35℃下,使用40%的PEG促融10 min,融合效率最高。从650株融合子筛选得到融合菌株RCS262,其摇瓶发酵虫草素含量达5 926μg·g~(-1),油脂含量达到37. 5%。采用原生质体融合技术进行蛹虫草与深黄被孢霉的种间杂交,成功获得融合菌株既能高产虫草素,也具有高效积累油脂的能力。     

枯草芽孢杆菌QM3原生质制备与再生研究

以青霉素、甘氨酸、溶菌酶和渗透压稳定剂等为影响因素,通过酶解,稀释平板计数等方法对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QM3原生质体的制备及再生条件进行了研究。结果表明菌株原生质体形成与再生的最适条件是:酶解缓冲液SMM pH=6.5,青霉素和甘氨酸的浓度分别为4U∕ml和4mg∕ml,时间2h;溶菌酶的浓度为2mg∕ml,在32℃下,酶解60min,形成率和再生率分别达到82.11%和89.2%。研究为枯草芽孢杆菌QM3原生质体的制备、再生条件及将其进行基因操作等相关研究奠定理论基础。     

4株石杉碱甲生产菌原生质体制备与再生条件的研究

为高效获得内生真菌U29、U32、U50、U51石杉碱甲生产菌株的原生质体和为原生质体融合及基因组改组选育高产石杉碱甲菌株提供参考,研究了溶解酶的浓度、加酶量、酶解温度、稳定剂等因子对4株菌原生质体制备的影响。通过研究获得了菌株原生质体制备的优化条件:溶壁酶浓度为3.0%、加酶量为2.0 m L/100 mg、菌龄为5 d、酶解时间为2.5 h、酶解温度为30℃、0.6 mol/m L氯化钠为稳定剂、CYM培养基为再生培养基。在此优化条件下,4株菌的原生质体的产量均大于7.0×10~7个/m L,再生率可达20%以上。     

蛹虫草原生质体的制备与再生

为了建立原生质体介导的蛹虫草遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对蛹虫草原生质体形成和再生的影响.蛹虫革菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为:1%Cellulase,30℃作用2 h;最适渗透压稳定剂是0.8mol·L-1MgSO4;最适合原生质体再生的培养基为含0.6mol·L-1蔗糖的PDA培养基.原生质体液涂布双层再生培养基的方法再生率最高,为4.38%.     

小麦纹枯病菌原生质体制备条件及再生菌株致病性研究

以小麦纹枯病菌HD-6为对象,进行原生质体制备与再生研究,并将再生菌株与原始菌株的致病性进行比较分析,为建立小麦纹枯病菌高效遗传转化体系提供依据.选用溶壁酶、崩溃酶、蜗牛酶、纤维素酶4种常见酶分别对小麦纹枯病菌进行酶解,并通过单因素试验分析酶解温度、酶解时间以及溶液pH值对原生质体得率的影响.结果表明,4种酶均能够裂解小麦纹枯病菌细胞壁得到一定数量的原生质体,其中崩溃酶的裂解效果最好,每克菌丝得到的原生质体数可达到2.6×108个.该酶的最佳反应温度是24℃,最适的酶解时间是3h,最适的pH值是6.0.获得的原生质体可以完成再生,并且再生菌株与原始菌株的致病力没有显著差异.     

响应面法优化平菇单核原生质体的制备及再生技术

为了提高平菇原生质体融合育种效率,本研究通过构建基于原生质体产量及单核原生质体再生率的响应面模型,优化平菇原生质体制备体系。以平菇菌株黑平16-1为试材,分别通过单因素试验考察菌丝菌龄(3～6 d)、酶液浓度(0.5%～2.0%)、酶解温度(28～34℃)和酶解时间(3～6 h)对原生质体制备及再生率的影响,并在单因素试验基础上,设计4因素3水平的响应面试验,建立各因素与响应值(原生质体产量和单核原生质体再生率)之间的数学模型,确定原生质体制备及单核原生质体再生的最佳提取工艺。结果表明,最佳提取工艺为菌龄4 d、酶液浓度1.51%、酶解温度28.3℃、酶解时间3.7 h,在此条件下平菇原生质体产量和单核原生质体再生率分别为(2.25±0.21)×107个·mL~(-1)和(6.80±0.42)%,与模型预测值接近(2.27×107个·mL~(-1)和6.83%),方程拟合度良好,该方法适用于对平菇原生质体的制备及单核原生质体再生条件的参数优化。     

一株木霉菌SWFC1511原生质体形成及再生条件的研究

研究了一株木霉菌SWFC1511菌株原生质体的制备及再生条件,并观察其原生质体释放过程。结果表明:木霉菌SWFC1511原生质体制备的最佳条件为:菌丝培养20 h后,用比例为1∶3的2%溶菌酶与2%蜗牛酶为酶解液,在35℃下酶解3 h后,原生质体的产量较高。所形成的原生质体在再生培养基1上的再生率较高。     

原生质体诱变选育高产多糖荷叶离褶伞菌株

研究了菌龄、渗透压稳定剂、酶系统、酶解时间等条件对荷叶离褶伞原生质体制备的影响,通过紫外线诱变技术筛选得到1株高产多糖的菌株。结果表明,原生质体制备最适菌龄为4 d,渗透压稳定剂为0.6 mol/L甘露醇,使用1%溶壁酶+1%蜗牛酶组合在30℃酶解2.5 h,原生质体产量可达1.38×107个/m L,再生率为1.27%。经诱变、筛选和遗传稳定性分析,获得1株多糖含量较出发菌株提高34.49%的突变菌株。     

枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株原生质体制备及再生条件研究

以枸杞内生真菌Fusarium nematophilum NQG8Ⅱ4菌株为材料,利用单因素试验和响应面法对影响原生质体制备的4个因素（菌龄、酶解时间、酶质量浓度、稳渗剂浓度）进行优化,获得原生质体制备的最佳条件。确定酶解时间,酶质量浓度,稳渗剂浓度三因素对原生质体产量、原生质体再生率和有效原生质体量的组合效应。结果表明,NQ8GⅡ4菌株原生质体制备的最佳条件为：过滤收集菌龄16 h的菌丝0.05 g于 1 mL质量浓度为30.30 g/L崩溃酶+10 g/L溶壁酶的酶解液中反应2.5 h;以0.713 mol/L NaCl为稳渗剂,原生质体产量平均为7.12×107 mL^-1,再生率平均为5.56%,有效原生质体量平均为39.59×10mL^-1,与模型预测值拟合较好。获得枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株原生质体制备的最佳条件,为该菌株在原生质体诱变、基因组重排、基因编辑技术等后续分子遗传学研究提供理论基础。     

肠型点状产气单胞菌和鱼害粘球菌原生质体融合的耐药性遗传标记的选择

为了对肠型点状产气单胞菌58－20－9菌株和鱼害粘球菌G4菌株的融合子进行选择鉴定，应用定性和定量药物敏感性试验，对两种蓖原生质体融合的遗传标记进行了筛选，结果表明，这两种细菌对红霉素和庆大霉素交叉耐药，在此基础上，测定了红霉素和庆大霉素在选择培养基中的适用浓度，筛选出肠型点状气单胞菌58－20－9菌株的遗传标记为Em^r（红霉素抗性），鱼害粘球菌G4菌株的遗传标记Gm^r（庆大霉素抗性）。     

利用原生质体融合技术构建梨孢属融合子的研究方法初探

鉴于有性世代形成能高的稻瘟病菌菌株有限,稻瘟病菌间的杂交组合难于获得,从而很难对一些重要基因,如无毒基因,抗药性基因等进行遗传分析及深入研究.本研究利用原生质体融合技术获得梨孢菌的杂合子,从而评价该体系用于遗传研究的可行性.首先,利用转基因技术获得稻瘟病菌Y93-164a-1跟蟋蟀草病菌SA98-4的抗药性转化子,然后将两个菌的稳定转化子的原生质体进行融合,之后进行连续5次的继代培养,最后进行3次单孢分离来挑选稳定的融合子.结果表明,利用原生质体融合技术在两个不同致病型的梨孢菌之间能获得稳定的融合子,初步表明利用原生质体融合技术组建梨孢菌的融合子群体用于遗传分析在技术上是可行的.

Abstract：

The genetic analysis of important genes, e. g. avirulence genes, antibiotic resistant genes in Magnaporthe oryzae pathogens had been limited because of the difficulty of getting highly fertile strains for genetic cross, especially in Oryza pathotype strains. In the present study, an alternative method for the genetic study of this fungus was tried by using the protoplast fusion system. Firstly, drug-resistant transformants were generated from the Oryza strain Y93-164a-1 and Eleusine pathotype strain SA98-4, then protoplasts of both selected transformants were fused by protoplast fusion technique. Stable fusants were selected after at least five subcultures and three single-spored isolations on the selective medium. Results suggested that the stable fusants can be easily obtained by protoplast fusion system, showing the protoplast fusion system could be usable for genetic analysis of M. oryzae pathogens.     

芦荟原生质体融合的研究

以芦荟叶片为试材,采用酶解方法进行原生质体分离,并在此基础上对斑纹芦荟和不夜城芦荟进行原生质体融合。结果表明,以芦荟的叶肉细胞为试材,可成功分离出原生质体,而且活力较高,达90%以上。聚乙二醇（PEG）融合的结果可获得部分融合体。芦荟原生质体的成功分离主要取决于材料的来源、酶液的组成,另外还受酶解液的渗透压、温度和pH值等影响。融合的效率主要受融合剂的浓度、原生质体的生理状态及处理的时间等影响。     

应用原生质体融合技术培育平菇与杏鲍菇优良新菌株

为了培育出具有优良互补性状的平菇和杏鲍菇新菌株,以高产、抗杂能力强的平菇品种CCEF89和优质、适应性强的杏鲍菇品种PL7为亲本菌株,建立原生质体聚乙二醇(PEG)融合体系,得到最佳融合条件:两亲本原生质体数量按1∶1混合,30% PEG 6000,0.01 mol·L^-1Ca²⁺,32 ℃水浴30 min,融合率达0.010 1%~0.028 2%。通过拮抗反应试验和Rep-PCR分子鉴定,从515个融合再生菌株中获得12个融合菌株P1~P12;出菇试验表明,P1和P5为杏鲍菇新菌株,其他为平菇新菌株。P1和P5的产量、生物学效率均显著高于其亲本菌株PL7,并且抗杂能力显著提高;与亲本菌株CCEF89相比,平菇新菌株P4、P10和P11长满培养料和形成原基的时间缩短5.5~7.3 d,第1茬平均产量提高18.0%~24.0%,总生物学效率提高21.00%~27.67%。利用原生质体融合技术培育出了具有亲本优良互补性状的平菇和杏鲍菇新菌株,为同时进行2种不同食用菌的种质资源创新和新品种选育提供了一种新途径。     

香菇种间原生质体融合

以爪哇香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｓｊａｖａｎｉｃｕｓ）和香菇（Ｌｅｎｔｉｕｎｓｅｄｖｌｕｅｓ）为亲本进行种间原生质融合。以营养缺陷型和单亲原质体灭活为融合子筛选标记，ＰＥＧ－Ｃａ＾２＋系统促融合，在ＩＲＭＭ培养基上检出融合子，经荧光核杂色，拮抗试验，同工酶谱分析等检验融合子，通过固体栽培试验选出可以结实的融合子Ｆ０４菌株，试验结果显示，Ｆ０４具有生长快，易结实的特性。     

利用原生质体融合技术构建植酸酶、纤维素酶枯草芽孢杆菌工程菌的研究

以产植酸酶枯草芽孢杆菌(A5)复合诱变的再生突变株Z56和产纤维素酶枯草芽孢杆菌(B6)复合诱变的再生突变株X57为亲本,利用双亲灭活原生质体融合技术进行种内融合,构建可同时产植酸酶、纤维素酶的工程菌。结果表明,从构建的385个融合子中筛选到6株两种酶活性相对较高的工程菌,其中R4、R5的纤维素酶产量高于亲本,植酸酶产量也相对较高;粗酶液用90℃处理10min后,纤维素酶剩余酶活分别为对照的62%和58%,植酸酶剩余酶活分别为对照的73%和71%。     

原生质体融合技术及其在微生物遗传育种上的应用

原生质体融合技术是微生物遗传育种上一项重要技术,它具有遗传信息传递量大,不受亲缘关系的影响,可有目的地选择亲株以选育理想的融合株,便于操作等优点,在遗传育种中具有广阔的应用前景。本文从原生质体的制备及其影响因子、原生质体融合的促融方法、原生质体融合子的筛选以及融合技术在微生物菌种选育中的应用等方面进行了综述。     

利用原生质体融合技术提高杂草生防菌对野燕麦的防效

选用对野燕麦有强致病力的候选优势菌株燕麦镰孢GD 2和多孢木霉HZ 31作为亲本,采用原生质体融合技术进行菌株改良,通过野燕麦种子萌发的抑制效果及温室抑草活性作用筛选出性状优异的融合子。结果表明,获得的3个性状各异的融合子进行离体生测后,融合子R2对野燕麦种子萌发的抑制效果显著高于燕麦镰孢GD 2,而与多孢木霉HZ 31的效果相当,盆栽致病力测定时融合子R1对野燕麦的鲜质量防效值高于双亲菌株,达68.03%。选用两种不同作用机制的生防菌株作为亲本进行融合,筛选获得防效优于亲本的微生物融合菌株R1。     

重寄生链霉菌F46与链霉菌SC1融合子的筛选

运用原生质体融合技术将重寄生链霉菌F46与生防链霉菌SC1融合,获得40株融合子.依据形态特征、皿内拮抗试验对获得的融合子进行初筛,发酵液抑菌活性测定,筛选出2株抑制效果明显的融合子FSf-11和FSf-13.皿内拮抗试验结果表明,2个融合子对灰葡萄孢(B.cinerea)有明显的抑制作用,抑制率比亲本SC1分别提高了27.99%和20.56%,镜检发现灰葡萄孢的基内菌丝畸形,经FSf-13处理后还出现原生质凝聚现象.融合子的发酵滤液对胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)抑制效果显著,抑菌圈直径超过了20 mm;融合子FSf-11的发酵滤液对尖镰孢萎蔫专化型(F.oxysporum f.sp.vasinfectum)和大丽轮枝菌(V.dahliae)的孢子萌发抑制作用最强,其孢子萌发率低于10%;融合子FSf-13对2种靶标菌的孢子萌发抑制率也超过了50%.     

灵芝原生质体融合HH系列菌株的选育研究

以灵芝菌株韩芝和红芝为亲本,进行原生质体融合,获得125株再生菌株,其中有锁状联合的菌株103株。与亲本的拮抗结果显示,在与双亲均有拮抗的20株中,10株能正常形成子实体,但菌株间性状差异显著,其中HH55、HH58和HH87具有突出的农艺性状,具有进一步开发应用的价值。