月季切花乙烯受体ETR1 cDNA克隆及其序列分析*

 根据乙烯受体基因ETR1 保守区设计引物, 分别以瓶插寿命差异显著的月季切花品种‘德克萨斯’和‘维亚蒂’为材料, 通过RT-PCR 从花瓣中扩增出了797 bp 的cDNA 片段, 它编码265 个氨基酸。测序和序列分析表明,‘德克萨斯’重组质粒中插入片段的核苷酸序列之间完全相同, 命名为pRT-ETR1。而‘维亚蒂’所获得的重组质粒中插入片段的核苷酸和氨基酸序列之间存在差异, 同源性分别为85. 2 %和92. 1 % , 分别命名为pRV-ETR1-V4 和pRV-ETR1-V5。pRV2 ETR12V5 的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’pRT2 ETR1 的同源性均达99 %以上; pRV-ETR1-V4 中的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’pRT-ETR1 的同源性分别为85. 0 %和92. 5 %。上述插入片段与桃、苹果、天竺葵、拟南芥等植物的ETR1相应区域高度同源, 其氨基酸同源性均大于90 %。     

乙酰水杨酸调控猕猴桃果实后熟软化进程中的Ad-EXP1基因表达

以布鲁诺猕猴桃(Actinidia deliciosa cv.Bruno)成熟果实为材料,根据植物α-expansin(EXP)基因的氨基酸保守序列设计简并引物,利用RT-PCR方法结合3’RACE扩增得到1个长为957bp的cDNA片段(Ad-EXP1)。该基因片段编码211个氨基酸,与其它植物该基因核苷酸同源性为59%～85%,氨基酸同源性为73%～91%。Northern杂交结果表明,Ad-EXP1基因在采收当天的果实中表达很弱,随着果实成熟衰老进程加快趋于增强;乙酰水杨酸(ASA)处理延缓果实后熟软化和乙烯生成,也显著抑制Ad-EXP1基因表达。鉴于Ad-EXP1表达丰度与乙烯生成、果实软化程度的一致性,推测该基因在猕猴桃果实后熟软化进程中起着重要作用。     

冬枣两个乙烯受体编码基因的克隆及序列分析

 根据植物乙烯受体ETR1家族氨基酸和核苷酸的保守区序列设计简并引物, 通过RT2PCR从半红期冬枣果实中分离了两个1 058 bp的乙烯受体cDNA片段。在分析已知序列基础上, 分别通过3′RACE及对两个基因上游5′端编码区的扩增, 得到了两个包含完整开放阅读框(ORF) 以及3′端非编码区( 3′UTR) 的乙烯受体编码基因, 即ZjETR1和ZjERS1。它们分别编码738个和632个氨基酸。这两个编码基因的氨基酸与其它植物乙烯受体氨基酸高度同源, 分别属于ETR1亚类和ERS1亚类乙烯受体。     

中矮1号梨砧木(S_2)PGIP基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,根据GenBank中梨属PGIP基因序列设计1对特异引物,以梨矮化砧木S2叶片总RNA为模板,克隆到1条约1100bp的cDNA片段,将其与pMD18-Tvector连接后转化Escherichia coli JM109,对筛选到的阳性克隆进行序列测定并使用生物信息学方法对所得结果进行综合分析。结果表明,克隆片段为梨PGIP基因,该cDNA编码330个氨基酸,预测分子量为36388ku,第1～24个氨基酸残基是信号肽。与梨属其它种中已获得的PGIP核苷酸序列开放阅读框(Open reading frame,ORF)的同源性为97.5%～99.6%,氨基酸序列的同源性为97.6%～99.1%。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

将来自北京地区甘蓝和芥菜上的TuMV外壳蛋白基因片段分别克隆到pMD18-T载体中,测序并进行序列分析。结果表明:两者CP基因序列长度均为867个核苷酸,编码288个氨基酸,它们的核苷酸同源性为97·2%,氨基酸同源性为97.6%;两者与GenBank中的部分CP基因序列的核苷酸同源性在87.8%~97.8%之间,氨基酸同源性在91.7%~99.0%之间;分子进化树分析两者可归属World-B组。     

潍坊萝卜中芜菁花叶病毒分离物的分子特性及CP基因的表达

 从表现红心病的潍坊萝卜块根上得到一芜菁花叶病毒( Turnip m osaic virus, TuMV) 分离物(TuMV-Ra) , 通过RT-PCR获得了该分离物的外壳蛋白(CP) 基因, 对其进行了序列测定, 并将其核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中登录的其它20个TuMV萝卜分离物的相应序列进行比较和分析。结果表明, TuMV-Ra与这20个分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89.9% ～99.0% , CP氨基酸序列同源性为94.8%～99.7%; 其中与中国浙江杭州萝卜的两个分离物HZLB1、HZLB2同源性最高, 核苷酸序列的同源性为98.7%和99.0% , 氨基酸序列同源性为99.0%和99.7%。TuMV-Ra与1999年从表现相同症状的潍坊萝卜得到的分离物CHINA-WF CP基因核苷酸同源性为93.66% , 氨基酸同源性为96.53% , 说明病毒发生了比较大的变异, 而且变异的位点主要在CP的N末端。将TuMV-Ra CP基因克隆到原核表达载体pET-22b ( + ) , 在大肠杆菌BL21 (DE3) 中表达出分子量为38 kD的融合蛋白。Western blotting分析证明TuMV-Ra CP在大肠杆菌中得到了正确表达。     

龙眼APETALA1(AP1)同源基因的克隆与序列分析

根据植物APETALA1(AP1)同源基因的高度保守性,设计合成一对特异引物,从龙眼基因组DNA中扩增出一条长400bp左右的基因片段,插入到pMD-T载体中。测序后分析表明,扩增得到了龙眼AP1同源基因片段。该片段序列包含两个内含子(长96bp和165bp),编码区编码36个氨基酸。与其它植物AP1同源基因的相应区域氨基酸序列具有较高的同源性,其中与花椰菜AP1基因同源性高达91%,与欧亚种葡萄、苹果、柑橘、枇杷的AP1基因同源性都在80%以上。     

部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析

 对来自国内不同地区、不同蔬菜作物上的8个黄瓜花叶病毒分离物, 采用一步法RT-PCR扩增得到CP基因全长片段, 分别克隆到pMD-18T载体并测序。结果表明, 本研究8个分离物的CP基因均为657个碱基, 可编码218个氨基酸, 它们之间的核苷酸序列同源性较高, 达92.8% ～99.1%; 将它们与GenBank中部分CMV CP基因序列比较, 显示出与CMV亚组Ⅰ株系的核苷酸序列同源性达90.7%～98.0%, 而与亚组Ⅱ株系的核苷酸序列同源性仅有75.8%～78.1%。因此, 这8个分离物应归属于CMV亚组Ⅰ。     

砂梨扩展蛋白基因cDNA克隆及全序列分析

设计植物EXP扩展蛋白简并引物,以砂梨果实cDNA为模板,克隆得到EXP基因cDNA片段,该片段长465 bp。根据该片段序列,分别设计2条5’和3’末端扩增的特异引物,利用RACE技术,获得了该片段的5’端和3’端序列。用DNAMAN5.22软件对3个序列进行拼接和分析,获得了该基因的cDNA全长,命名为Pyp-EXP。该cDNA全长为1 395 bp,5’端起始密码子ATG始于72 bp,3’端终止子TAG止于830 bp,Ploy+(A)从1 363～1 395 bp。该基因已在GenBank基因数据库注册,注册号为EF602031。Pyp-EXP核苷酸序列有一个759 bp完整的开放阅读框,编码区与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃的同源性分别为96%,96%,94%和86%;该cDNA推导编码252个氨基酸,含有1个组氨酸(His_Phe_Asp,HFD)功能域,与西洋梨、苹果、湖北海棠、桃中相应序列同源性分别为98%,97%,95%和93%。该基因的克隆为研究扩展蛋白的时空表达及其在果实发育和成熟过程中的作用奠定了基础。     

滇黑两省黄瓜花叶病毒南瓜分离物外壳蛋白基因序列分析

 利用免疫捕捉多聚酶链式反应( Immuno-Capture PCR, IC-PCR) 方法从南瓜的两个黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV) 云南分离物(CMV-YN) 和黑龙江分离物(CMV-HLJ ) 中扩增获得约700 bp的外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因片段, 并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明, CMV-HLJ和CMV-YN两个分离物CP基因长为657 bp, 编码219个氨基酸, 两个分离物的核苷酸和氨基酸同源性分别达到96.8%和97.4%。和国外CMV亚组Ⅰ 6个分离物核苷酸序列同源性在90%以上, 氨基酸同源性在97%以上, 和亚组Ⅱ 6个分离物的同源性分别为66.4%和73.4%。和国内亚组Ⅰ10个分离物的核苷酸同源性都在89.5%以上, 氨基酸同源性在93%以上, 而和亚组Ⅱ两个分离物的同源性分别为68.3%和73.5%。序列分析结果表明CMV-HLJ和CMV-YN两个分离物属于CMV亚组Ⅰ。     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.     

温度和GA_3对桃果实采后乙烯合成及桃ETR1同源基因表达的影响

为明确桃果实采后成熟衰老期间乙烯的合成与桃ETR1同源基因之间的关系,进一步了解乙烯的转导和作用过程,设计合成了桃ETR1扩增引物RTetr1和RTetr2,用RT-PCR方法研究了温度和GA3处理对白凤桃(Amyg-daluspersicaL.)果实采后乙烯生成和桃ETR1同源基因表达的影响。结果表明,低温处理降低了果实乙烯释放量,低温+GA3处理不仅降低了果实乙烯释放量,还延缓乙烯释放高峰期。PCR分析表明,桃ETR1的cDNA合成受温度和GA3调节,随着乙烯合成能力的增强,ETR1同源基因的表达水平增加,在乙烯信号转导过程中呈正向表达模式。     

桃果实ACC合酶cDNA的克隆

根据其它植物ＡＣＣ合酶氨基酸保守区设计两组简并引物,用套式ＰＣＲ技术从桃成熟果实ｃＤＮＡ中扩增出１．１ｋｂ大小特异性片段,将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,对重组克隆ｐＰＡＣＳＩ进行全序列测定表明,插入片段全长１１００个碱基,编码３６６个氨基酸,该基因与番茄、笋瓜、小西葫芦、康乃馨、苹果ＡＣＣ合酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为７２．７％,７１．３％,７１．１％,６９．１％,６５．４％。ＲＮＡ点杂交表明ｐＰＡＣＳＩ基因随着桃果实成熟表达活性增强,乙烯处理能诱导桃果实该基因的表达。     

乙烯受体与果实成熟调控

 综述了有关乙烯受体和果实成熟衰老研究的最新进展，主要包括拟南芥乙烯受体和信号转导，番茄等果实乙烯受体家族基因的表达与功能研究，果实乙烯受体基因表达的调节等，对今后乙烯受体的相关研究前景作了展望。乙烯受体转基因等研究结果表明，乙烯的作用可以在受体水平实现高度调节。     

早熟砂梨‘翠冠’hmgr基因家族两成员的表达与货架期黑皮病关系的研究

 以砂梨黑皮病易感品种‘翠冠’果实为材料,克隆获得了调控α-法尼烯合成的关键限速酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）基因家族中的两个成员Pphmgr1和Pphmgr2。Pphmgr1开放阅读框为1 827 bp,编码由609个氨基酸残基组成的蛋白;Pphmgr2开放阅读框为1 707 bp,编码由569个氨基酸残基组成的蛋白。序列比对结果显示：‘翠冠’PpHMGR1和PpHMGR2与苹果果实的MdHMGR1和MdHMGR2蛋白的同源性分别达到90%和98%。在采后货架期28~32 ℃条件下,乙烯受体抑制剂1-MCP 可明显抑制果实呼吸率,减缓乙烯释放,显著降低果皮中α-法尼烯及其氧化产物共轭三烯的含量,减少黑皮病发病率并减轻发病程度。半定量RT-PCR结果显示1-MCP处理后果皮中Pphmgr2的表达受到显著抑制,但是Pphmgr1的表达几乎不受影响。     

基于乙烯受体下游转录因子的果实品质调控机制研究进展

近年来乙烯作用机制的研究已陆续从乙烯受体等上游级别延伸至下游转录因子（EIN3/EIL和AP2/ERF）,其中转录调控机制是研究热点之一。本文综述了基于乙烯受体下游转录因子的果实品质调控研究进展,讨论了果实品质转录调控存在的问题和研究趋势。     

猕猴桃和桃果实脂氧合酶活性测定方法的建立

以猕猴桃、桃成熟果实为试材,建立了一个测定果实组织中的脂氧合酶(LOX)活性的分光光度法检测体系,以亚麻酸为底物的LOX活性测定反应体系的最适pH分别是5.0～5.5和6.0;应用该技术体系检测不同处理对成熟果实组织中的LOX活性影响,得到了满意的结果。