李属坏死环斑病毒辽宁桃树分离物基因组分析

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)辽宁桃树分离物全长基因组。用Vector NTI Advance 11软件进行基因组结构注释。用SDTv.1.0软件分析该分离物与Gen Bank中公布的其他PNRSV分离物间的核酸一致性,并用MEGA5.0软件和RDP3软件对各PNRSV分离物进行系统发育分析和重组分析。结果显示:PNRSV辽宁桃树分离物基因组由3条正义单链RNA组成。RNA1由3 332个核苷酸构成,具有一个开放阅读框(nt 30~3 167),编码一个约117.0k D的复制酶相关蛋白P1。RNA2由2 591个核苷酸构成,具有一个开放阅读框(nt 27~2 426),编码一个约99.0 k D的复制酶相关蛋白P2。RNA3由1 943个核苷酸构成,具有两个互不重叠的开放阅读框分别编码一个运动蛋白(nt 175~1 026)和一个外壳蛋白(nt 1 100~1 774),这两个开放阅读框的间隔区为73个核苷酸。PNRSV辽宁桃树分离物的RNA1、RNA2和RNA3与其他已经公布的PNRSV分离物间,核酸序列一致性分别为91.8%~98.8%,93.3%~99.2%和87.7%~99.0%。基于RNA1、RNA2和RNA3全长序列构建的系统发育进化树,分别将已报道的PNRSV分离物划分为3个、2个和3个组,PNRSV辽宁桃树分离物分别属于RNA1Ⅰ组、RNA2Ⅰ组和PV96组。基于RNA1、RNA2和RNA3全长序列进行的重组分析表明各PNRSV分离物基因组间不存在重组。PNRSV辽宁桃树分离物基因组序列是世界首个来源于桃树的PV96组基因组序列。     

番木瓜PRSV和PLDMV复合侵染中呈中性互作

商业化的抗番木瓜环斑病毒（papayaringspotvirus,PRSV）的转基因番木瓜品种‘华农1号’的应用成功控制了华南地区该毁灭性病毒。然而近年来在广东和海南的一些转基因或非转基因植株上发现了另一种具有严重危害的病毒——番木瓜畸形花叶病毒（papayaleafdistortionmosaicvirus,PLDMV）。为了明确这两种病毒在番木瓜上的相互关系,通过人工接种分析二者在转基因和非转基因番木瓜上的侵染率、症状、细胞病理变化以及病毒积累量等特征。结果表明,‘华农1号’对PRSV有很强的抗性,但对PLDMV却高度感病,且PLDMV并不能协助PRSV克服转基因番木瓜对其的抗性;两种病毒单独侵染和复合侵染非转基因番木瓜均能引致严重的症状,二者症状无明显差异。细胞病理学分析表明,病毒侵染后叶片叶绿体萎缩且排列不紧凑,复合侵染并未对叶肉细胞造成更为严重的损害。接种PRSV的转基因番木瓜15d后PRSV积累量逐渐减少,直至检测不到;而接种PLDMV后其积累量逐渐升高并保持在一个较高的水平。在转基因和非转基因番木瓜上,PRSV的积累量始终低于PLDMV,在非转基因番木瓜上,两种病毒长期共...     

番茄环斑病毒悬钩子分离物复制酶基因的克隆及序列分析

番茄环斑病毒(ToRSV)是一种高风险的检疫性有害生物,可侵染桃、李、葡萄、苹果、樱桃等多种植物。2000—2001年,我国从法国进口的葡萄插条上检出过此病毒。以ToRSV悬钩子分离物(Rasp-2)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒复制酶基因(RdRp)的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列测定结果表明,Rasp-2RdRp基因由2133个核苷酸组成,编码711个氨基酸;Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之间的蛋白酶切割位点为Q/V。Rasp-2与其他分离物及株系RdRp基因的核苷酸序列同源性为79%～84%,氨基酸序列同源性为89%～94%。聚类分析结果显示,葡萄黄脉株系(GYV)与其他分离物及株系关系最远,Rasp-2与其他分离物及株系亲缘关系较近。证实Rasp-2与另外2个悬钩子分离物Rasp和Rasp-1的核苷酸序列存在明显变异。     

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白的抗血清制备及其检测应用

 以受番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV）侵染的番木瓜（Carica papaya）叶片为供试材料,采用RT-PCR 方法克隆其外壳蛋白基因cp,并将其连接到原核表达载体pET-28b（+）上,酶切鉴定及克隆测序确定开放阅读框的正确性,将获得的重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌。通过摸索转化的表达宿主菌种类、IPTG 浓度及诱导时间,获得高效表达PRSV cp 的条件。SDS-PAGE 分析结果表明,CP 融合蛋白分子量为36.8 kD。以Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化的融合蛋白为抗原,免疫注射新西兰大白兔制备得到高效价抗体,间接ELISA 测定效价为1︰16 384。Western blot 检测结果表明,制备的抗血清可与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。通过ID-ELISA 检测田间样品证实了制备的抗血清与PRSV 侵染病叶发生了良好的特异性反应。本试验为PRSV 的快速检测以及PRSV 编码蛋白的功能研究奠定了基础。     

番木瓜环斑病毒致病特征及防治技术研究进展

番木瓜（Carica papaya Linnaeus）原产热带美洲,与香蕉、菠萝并称热带三大草本果树。2005年我国番木瓜栽培面积已达1万hm2,产量52万t。不仅广东、广西、福建等南方省份大规模种植,而且北方也有设施栽培。但由于番木瓜环斑病毒（Papaya Ringspot Virus,PRSV）的为害,番木瓜生产受到严重威胁,有的甚至绝产。番木瓜环斑病毒病已成为番木瓜生产的主要限制因子㈦。     

黄河蜜甜瓜果实致病真菌潜伏侵染的时期与途径

黄河蜜甜瓜在从开花至成熟的整个生长发育过程中,均可受到链格孢(Alternaria alternata)和镰刀菌(Fusarium spp.)的侵染,并且随着果实体积的膨大,这2种病原菌的带菌率明显提高。在花期花瓣的潜伏侵染率最高,在发育期、网纹形成期潜伏侵染率明显升高,并且A.alternata的侵染率明显高于Fusarium spp.的侵染率,在成熟期Fusarium spp.的潜伏侵染率略有下降。     

西瓜花叶病毒新疆鄯善分离物的纯化及不同甜瓜品种的抗病性鉴定

从新疆哈密瓜（Cucumis melo L.）主产区之一的鄯善县采集表现病毒病症状的哈密瓜嫩叶,经昆诺藜连续3次单斑分离纯化后,采用RT-PCR扩增、克隆和测序分析,将该分离物鉴定为西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）。利用该分离物,采用汁液摩擦接种法对12个常见的甜瓜商业品种和13个国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主进行室内抗病性鉴定,结果表明,所有供试品种中没有免疫和高抗品种,表现抗病、中抗、感病和高感的品种分别有1、11、10和3个,其中表现抗病的为Iran H。     

李属坏死环斑病毒(PNRSV)新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因(CP)片断的克隆与序列分析

【目的】为了查明新疆巴旦木果树病原病毒的种类,为病毒的分子检测提供基础。【方法】采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),从巴旦木果树叶片中检测到李属坏死环斑病毒(PNRSV)。以阳性样品的总RNA为模板进行PNRSV外壳蛋白基因(CP)RT-PCR扩增,对预期430 bp大小的4个扩增产物进行克隆、测序和序列分析。【结果】结果表明,PNRSV新疆巴旦木分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与世界各地已报道的分离物具有较高的同源性,分别为80.0%～97.2%和80.1%～94.1%,其中与阿根廷分离物AY217的同源性最高;而与同属03亚组的苹果花叶病毒(ApMV)同源性较低,仅为52.9%～55.4%和45.6%～48.6%。新疆PNRSV各分离物之间CP基因高度同源。序列比对与系统发生树的分析显示,PNRSV新疆巴旦木分离物的株系属于GroupⅠ组。【结论】确定了PNRSV为侵染新疆巴旦木果树的病原病毒。这是PNRSV在新疆发现的首次报道。     

原核表达的PRSV HC-Pro 基因同源dsRNA 诱导番木瓜抗性的研究

 利用番木瓜环斑病毒（PRSV）HC-Pro 基因3′端824 bp 区段,通过OZ-LIC 法构建了含有PDK 内含子的发夹RNA 编码结构,并选用pSP73 和M-Jm109LacY 分别作为宿主载体和宿主菌,构建了高效的同源dsRNA 原核表达工程菌M-Jm109LacY/pSP73-RNAi-H824,经IPTG 诱导表达的dsRNA 不被DNase I 和RNase A 降解,稳定性较好。采用喷洒dsRNA 粗制品的方式对番木瓜植株进行保护性处理和治疗性处理,症状观察及ELISA、Real-time RT-PCR 分析结果表明,保护性处理能有效诱发对番木瓜环斑病毒的抗性（发病率低,发病时间晚）;治疗性处理（植株已接种PRSV 25 d）能在处理初期引起番木瓜环斑病毒积累量发生短暂降低。     

红掌侵染性病害及其综合治理研究

红掌侵染性病害分布广,为害重,是影响和制约我国红掌种植产业发展的主要因素.概述了我国栽培红掌上的五大类17种侵染性病害的症状、病原及发病特点;并针对病害的综合治理技术进行了阐述,提出了以防为主,合理用药的防治策略.     

侵染白菜的黄瓜花叶病毒分离物基因组的全序列分析

对浙江省杭州地区白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. commuis Tsen et Lee.）上获得的CMV分离物（CMV-CTL）进行了全长克隆和基因组序列分析。结果显示：CMV-CTL的RNA1（GenBank序列号：EF213023）全长为3357个核苷酸（nt）,编码993个氨基酸（aa）的1a蛋白;RNA2 （GenBank序列号：EF213024）全长为3047 nt ,编码858 aa的2a蛋白和111 aa的2b蛋白;RNA3 （GenBank序列号：EF213025）全长为2217 nt,编码278 aa的MP蛋白和218 aa的CP蛋白。序列相似性分析表明,CMV-CTL与CMV亚组IB中株系IA相似性最高,RNA 1、RNA 2和RNA3与该株系的相似性分别为91.3%、91.3%和93.6%。CP基因和RNA 3 的5' NTR核酸序列系统发生树分析表明,CMV-CTL与中国大多数CMV分离物一样,属于CMV亚组IB。     

BTH处理网纹甜瓜对两种真菌潜伏侵染率的影响

分别于网纹甜瓜开花前7 d、幼果期（花后14 d）、果实迅速膨大期（花后21 d）和网纹形成期（花后28 d）用100 mg·L^-1 BTH对植株进行1、2、3、4次喷洒,分析BTH处理后幼果期、膨大期、网纹形成期和成熟期果实内链格孢（Alternaria alternata）和镰刀菌（Fusarium sp.）潜伏侵染率的变化。结果表明：采前BTH处理可有效控制甜瓜果实内两种真菌的潜伏侵染。1、2、3、4次处理均降低了两种真菌的潜伏侵染率,2、3、4次处理的效果较好,在成熟期总潜伏侵染率均为对照的23.53 %。网纹形成期是两种真菌潜伏侵染的关键时期。采前BTH处理对潜伏于果实内的两种优势病原菌链格孢和镰刀菌的控制效果存在差异,且对果实顶部、中部的控制效果优于底部。     

侵染节瓜的3种病毒多重PCR检测体系的建立

 根据侵染节瓜3种病毒——小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,初步建立了能同步、快速、灵敏地检测这3种病毒的多重PCR检测体系,为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。     

小西葫芦黄花叶病毒山东南瓜和丝瓜分离物全基因组序列分析

在山东泰安采集到两个表现黄花叶症状的丝瓜和南瓜样品中检测到小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV);通过RT-PCR和RACE方法获得了两个分离物的全基因组序列,分别命名为CN:Cm:17(丝瓜分离物)和CN:Lc:17(南瓜分离物)。结果表明,CN:Cm:17和CN:Lc:17基因组除Poly(A)尾巴外,分别含有9 593和9 591个核苷酸(Nucleotides,nt),通过多聚蛋白策略编码一个含3080个氨基酸的多聚蛋白。CN:Cm:17和CN:Lc:17在氨基酸水平上一致率为96.7%;CN:Cm:17与韩国分离物KR:RDA:07的氨基酸一致率最高(97.8%); CN:Lc:17与CN:CJLX30535:14和CN:spider131932:13的一致率最高(98.4%)。重组分析发现,CN:Lc:17具有显著重组事件,为KR:KR-PA:05和CN:Cm:17的重组体。基于多聚蛋白编码序列的系统进化聚类结果显示分组与分离物的地理起源存在密切相关性,所有中国分离物分别聚集在A-Ⅴ和A-Ⅵ亚组。     

甜瓜全基因组WRKY转录因子基因的鉴定与分析

WRKY转录因子是植物中一类重要的调控因子,调控植物的多种代谢和反应。以甜瓜基因组数据为材料,利用生物信息学手段对甜瓜中的WRKY转录因子进行了全基因组鉴定与分析。结果表明,甜瓜至少有65个WRKY转录因子,蛋白序列长度为97 769;甜瓜WRKY转录因子可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3大类,它们处于进化树的不同分支。除保守的WRKYGQK序列外,共发现WRKYGKK和WRKSYYR 2个变异的WRKY结构域类型。     

甜瓜属人工异源四倍体早期基因组变化的初步研究

 利用AFLP技术对甜瓜属人工异源四倍体(Cucumis ×hytivus Chen and Kirkbride, 2n = 38) 不同自交世代及二倍体亲本DNA进行分析, 结果表明多倍体基因组在形成早期发生了广泛的变化, 变化位点所占比例高达22.2%。基因组序列变化始于F₁ 代, 最高变化率出现在S2 代。基因组变化主要表现为部分亲本片段丢失、新片段产生以及后代对亲本某些位点的跳跃式继承。还观察到部分双亲差异性条带呈现出偏父性遗传的特点。     

苹果锈果类病毒山东文登峰山分离物的克隆

苹果锈果病又名花脸病或裂果病,是严重影响苹果生产的主要病毒病之一.广泛分布于东北、西北、华北各苹果产区,目前仍有扩大蔓延趋势.其病原物为苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid,ASSVd）,主要侵染苹果和梨,最新研究发现还可侵染桃、杏、樱桃核果类果树.感病苹果因品种和环境条件的变化果实表现为5种病状：锈果型、花脸型、锈果-花脸型、环斑型和绿点型,发病较重的果实发生畸形龟裂,大大降低果品的食用价值和经济价值.对文登峰山地区富士苹果进行ASSVd扩增和克隆,以期明确ASSVd在文登地区富士苹果上的变异情况.     

5种病毒侵染葫芦科作物的症状观察

对小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、西瓜花叶病毒(WMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、番木瓜环斑病毒西瓜株系(PRSV-W)和南瓜花叶病毒(SqMV)人工接种侵染7种葫芦科作物后的症状反应进行了初步的观察和探讨,初步筛选出SqMV与南瓜(耳突)、西葫芦(锯齿状叶缘),ZYMV与西葫芦(蕨叶),丝瓜(锯齿状叶缘),CMV与丝瓜(子叶早期褪绿斑)、西葫芦(后期叶片坏死斑)等几种具有比较鉴定作用的植物与病毒的组合。     

李坏死环斑病毒诱导的桃PpPDS沉默体系的优化及验证

病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是在桃（Prunus persica）上进行基因沉默的主要手段,现有VIGS体系效率较低,亟待开发针对桃的高效沉默体系。以桃八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene desaturase）基因PpPDS为指示基因,探究不同侵染方式、病毒载体、温度、接种苗龄和菌液浓度对桃叶片VIGS效率的影响。结果表明,在侵染方式上,叶片注射是有效的方式;李坏死环斑病毒（Prunus necrotic ring spot virus,PNRSV）载体（pCaRNA1/2和pCaRNA3）优于烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）改造后的TRV载体（pTRV1和pTRV2）;温度为22℃左右PpPDS的沉默效率较高;苗龄为5～6片完全展开叶的桃苗沉默效率较高,达到85%;菌液浓度为OD600=1.0时沉默效率较高。以优化好的VIGS体系参数,选择桃叶绿素合成基因（PpGluTR和PpPOR）为目标基因进行验证,结果显示PpGluTR和PpPOR的表达均被显著抑制,叶片颜色变化明显。这些结果表明优化...     

一种简单的甜瓜白粉菌单孢子分离方法

为了建立一种新的甜瓜白粉病病原菌单孢子分离方法,采用眉毛挑针挑取法,即在实体解剖镜下,在水琼脂培养基上直接挑取单个孢子进行活体分离纯培养。结果表明,此方法简单快速、操作方便、易于掌握,非常适用于孢子较大且活体寄生的病原菌。首次建立了甜瓜白粉病单个孢子活体分离纯培养的方法,为甜瓜白粉病生理小种及相关育种研究奠定了基础。