尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体的筛选及插入基因分析

在建立T-DNA插入突变体库的基础上,为筛选出致病力明显下降的突变体并明确其插入位点信息,对突变体的培养表型和致病性差异进行测试,研究结果为进一步阐明尖孢镰刀菌致病分子机制奠定基础。在前期构建的T-DNA插入突变体库中,采用PCR检测筛选了300株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态、生长速率、产孢量、遗传稳定性等生物学性状,用海棠胚根接种法比较突变体致病力差异,对筛选到的致病力明显减弱的突变体进行插入位点侧翼序列分析及Southern杂交分析。结果显示,283个供试突变体都已插入目的基因,并伴有绿色荧光。将T-DNA插入突变体连续转接培养5代后,在含潮霉素B的培养基上能稳定遗传,且菌落形态和颜色无明显改变;在对283株突变体进行致病性测定中,87.9%的突变菌株致病力减弱,在致病力减弱的突变体中,HS2-520、HS2-1016和HS2-2109几乎丧失了致病性。选取8株致病力明显减弱的突变体进行Southern杂交分析,结果显示,其中6株突变体为单拷贝插入菌株,1株为双拷贝插入菌株。对这8株突变体进行了TAIL-PCR侧翼序列扩增,经公司测序,与野生菌株HS2基因组序列比对后获...     

水稻T-DNA插入群体的建立及突变体筛选

为了给水稻功能基因组学研究提供材料,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化法转化水稻品种日本晴(Oryza sative L.ssp.japonica cv.Nipponbare),共建立了1833株独立的水稻T-DNA插入群体.T0通过PCR、GUS染色和southem blot分析证明了再生植株为转基因植株.随机选取种植T1种子20粒,进行突变体筛选.通过对各个时期表型的观察和接种试验,共发现突变体208个,突变率为11.3%,表型涉及株高、叶片、穗型、生育期、颖花、颖壳着色、抗病性等.这些突变体不仅创造了具有优良农艺性状的水稻育种材料,为水稻育种提供新的基因资源,而且为水稻功能基因组研究打下坚实的基础.     

油菜黑胫病菌T-DNA插入致病力减弱突变体的筛选及侧翼序列分析

为揭示油菜黑胫病菌的致病分子机理,基于已建立的Leptosphaeria biglobosa突变体库,随机挑选16个突变体,对其致病力进行检测,筛选到12个致病力下降的突变体.并对其中6个致病力显著减弱突变体的菌落生长特性、生长速率、产孢量进行测定,结果显示,T1、T3、T4、T7突变体与野生型nm-1菌落形态相比没有...     

一个 T-DNA 插入突变体的分子鉴定及表达分析

突变体在水稻功能基因组研究中具有重要的作用。对水稻OsFCA位点的插入突变体进行了分子鉴定,证实此突变体为纯合突变体,并且发现突变体与野生型植株相比,抽穗期明显延迟。通过RT-PCR结果分析表明, T-DNA插入的突变体植株中OsFCA基因完全不表达。另外,在短日照条件下,对水稻成花相关的2个重要基因Hd1和Hd3a的RT-PCR分析表明,在野生型植株中,2个基因的表达量都明显高于突变体植株,尤其是在夜间的表达量相差较为明显。说明OsFCA在短日照条件下通过正向调控Hd1和Hd3a的表达促进水稻的开花。     

大丽轮枝菌微菌核快速形成培养基的筛选

大丽轮枝菌是广泛分布的土壤习居菌,能引起棉花黄萎病害,因其形成的微菌核生命力强,可在土壤中存活多年,是大丽轮枝菌型黄萎病的主要初侵染来源。为开展微菌核的研究,本试验对微菌核形成最佳培养基进行了筛选,采用6种培养基,培养6株大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.),通过生长速率、微菌核数量、微菌核直径和微菌核萌发率4项指标筛选合适的培养基。结果表明：改良燕麦培养基形成微菌核的数量和直径均优于其他培养基;M1和BMM培养基形成微菌核的数量较多,其微菌核直径均小于半组合培养基。因此,改良燕麦、M1和BMM培养基,根据实验需要均可作为快速培养微菌核的理想培养基。     

大丽轮枝菌拮抗细菌的分离与抗菌物质鉴定

从黄萎病发病棉田未发病棉株根际土样中分离芽孢杆菌,利用对峙培养法对大丽轮枝菌进行平板拮抗实验,筛选出6株对大丽轮枝菌有拮抗作用的芽孢杆菌,其中3株菌发酵代谢产物具有抗菌活性。S4-3菌株发酵液滤液经100℃、30min热处理丧失抗菌活性,发酵液氯仿抽提物不具有抗菌活性,发酵液硫酸铵沉淀物有抑菌活性,但经蛋白酶处理后活性丧失,认为S4-3菌株抑菌活性物质是蛋白质。而菌株S4-5发酵液经100℃热处理后还有较高的抗菌活性,发酵液氯仿抽提物也具有抗菌活性,但硫酸铵沉淀物对病原菌无抑制作用;S5-6菌株发酵液滤液经100℃热处理丧失抗菌活性,硫酸铵沉淀物也不具有抗菌活性,而发酵液氯仿抽提物有抗菌活性,因此认为S4-5和S5-6菌株产生的抑菌物质不是蛋白质类。     

中国农科院首次揭示大丽轮枝菌导致棉花落叶致病机理

<正>中国农科院农产品加工研究所所长戴小枫研究员领衔的有害生物防控创新团队,经过多年对涉及8科、600多种寄主植物的大丽轮枝菌的跟踪研究,首次揭示了这一被称为植物"癌症"病原的真菌引起寄主落叶直至减产绝收的机理,为生物防治该菌、阻断棉花等作物黄萎病蔓延提供了新的靶点。相关研究成果日前在线发表于国际期刊《新植物科学家》。据介绍,大丽轮枝菌是一种毁灭性     

水稻T-DNA插入突变体库中Rubisco抗氧化胁迫株系的筛选

以水稻(Oryza sativa L. subsp. japonica)品种“中花11”构建的T-DNA插入突变体库为材料,用甲基紫精诱导叶绿体产生活性氧,通过SDS-PAGE电泳分析Rubisco含量相对于野生型的变化,筛选耐氧化胁迫的株系。结果表明,与对照相比,突变体材料各个株系叶片中的Rubisco小亚基的相对含量有较大差异,说明这种筛选Rubisco突变体的方法是可行的,且从中找到了两株Rubisco耐氧化胁迫的株系。     

大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析

由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起的棉花黄萎病,是一种危害严重的世界性病害。通过初筛和复筛得到了对棉花黄萎病具有较高拮抗活性的细菌菌株12-51,通过对其进行形态鉴定、生理生化特征鉴定和16S rDNA全序列分析,最终鉴定此菌株为Bacillus velezensis,16S rDNA序列相似度达99.74%。采用有机溶剂萃取和盐析法对发酵产物进行了提取,初步断定拮抗物质为蛋白类。通过对粗蛋白进行进一步研究发现,60%组分活性较高,并且对热以及酸碱敏感性较小。试验结果为棉花黄萎病的生物防治奠定了基础。     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库的构建及其表型分析

 以棉花强致病力黄萎病菌株V592为材料,利用农杆菌介导的T-DNA插入技术构建了一个含15000个转化子的突变体库,对突变体的生物学特性、致病力及T-DNA插入拷贝数进行研究,结果显示：(1) 突变体的菌落形态分为菌核型、中间型、菌丝型和菌膜型,分别占92.12%,4.54%,3.19%和0.15%;（2）菌核型、中间型和菌丝型菌株,在菌落生长速度和孢子大小方面无明显差异;而在产孢量方面,菌核型普遍强于中间型和菌丝型;（3）致病性测定显示,菌核型的致病力普遍强于中间型和菌丝型;（4）Southern杂交显示,T-DNA单拷贝数插入的突变体比率约为70.99%,而菌核型的单插入率为80.00%,明显高于中间型(69.23%)和菌丝型(64.71%)。以上结果表明,农杆菌介导转化技术可用于棉花黄萎病菌突变体库的快速构建,突变体的菌落表型与其产孢能力、致病力及T-DNA插入拷贝数等之间存在一定的相关性。     

大丽轮枝菌混合侵染棉花的研究

利用绒毛型变异体 (B型 )的形态特征 ,采用不同形态类型的菌株混合接种、再分离后分别进行致病力和营养体亲和性测定的方法 ,证明不同致病力的大丽轮枝菌菌株可以共同侵染同一株植物 ,在菌株间不同浓度混合比例的接种中 ,混合侵染率约占总侵染率的 1 /1 5至 1 /3。是一种研究不同致病力的菌株在寄主体内互作动态和分布情况的简便方法。由此提出在黄萎病研究中为防止不同致病力菌株对研究结果的干扰 ,应以使用单孢菌株为宜 ;由于形态变异体容易识别 ,在研究棉花黄萎病的交叉保护现象中可加以利用     

大丽轮枝菌致萎毒力指示菌的筛选及拮抗作用初探

为了筛选可指示Verticillium dahliae致萎毒素毒力大小的指示菌,并对致萎毒素抑制指示菌生长的机理进行初步探讨,采用指示菌平板打孔法,对黑曲霉(Aspergillus niger)BF-3758、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等12种具有微生物种属代表性的菌株进行筛选;采用拮抗试验、致萎试验结合显微观察的方法,初步探索了Verticillium dahliae致萎毒素对指示菌生长的抑制作用。结果表明,Verticillium dahliae粗毒素对Aspergillus niger BF-3758的生长具有较强的抑制作用,且该抑制作用和粗毒素对离体叶片的致萎作用具有一致性,并存在一定的量效关系,Aspergillusniger BF-3758菌株可以作为Verticillium dahliae致萎毒素的毒力指示菌;Verticillium dahliae粗毒素可抑制Aspergillus niger BF-3758的孢子萌发和菌丝生长,对成熟菌丝也有破坏作用。上述研究可为评价Verticillium dahliae的致病力提供一种操作简便、耗时短、费用低的生物学方法。     

棉花黄萎病菌插入突变体库的构建及致病相关基因DVK1的克隆与鉴定

 利用ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）技术自建Verticillium dahliae强致病力落叶型菌株T-DNA插入突变体库,共获得5000个转化子;随机挑选1000个转化子进行致病力鉴定,筛选获得5株致病力衰退的突变体。挑选致病力下降最为明显的突变体d1,通过TAIL-PCR技术最终获得一段长3237 bp的DVK1全长cDNA序列,编码1079个氨基酸的蛋白。基于DNA序列比对发现,DVK1基因含有2个内含子,分别为52 bp和36 bp。进一步比对发现T-DNA插入到DVK1基因启始密码上游740 bp的启动子中。通过遗传互补实验d1 恢复了致病性,进一步证明DVK1基因与黄萎菌致病性相关。     

大规模T-DNA插入突变体筛选中所需T2代最小样本容量的确定方法

在利用T-DNA插入,大规模产生突变体的工作中,通常将一定数量的T1代植株混合收获,建立T2代种子池,然后以池为单位进行突变体筛选。本文提出了在一定概率保证下,确定突变体筛选所需的最小样本容量(种子数量)的方法,以期能够既不遗漏突变体,又不浪费人力物力。     

橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及插入位点分析

橡胶树炭疽病主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起,是影响橡胶产量的重要病害之一。病原菌功能缺失突变体的构建是研究病菌致病分子机理的有效手段。为了获得充足的胶孢炭疽菌突变体用于解析其致病机理,本研究对根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系进行优化。结果表明,当AGL-1农杆菌OD_(600)=0.8、胶孢炭疽菌孢子浓度为10~6个/mL、乙酰丁香酮(AS)浓度为100μmol/L时,共转化48 h,可使转化效率达到480个转化子/106个孢子。基于这个体系,构建了一个库容量为861的T-DNA突变体库。随机挑选8个转化子进行PCR验证,结果均为阳性。从突变体库中筛选出1株致病力下降的突变体,对其进行TAIL-PCR扩增插入位点侧翼序列,得到一个750 bp序列进行序列测定。通过与野生型菌株基因组进行序列比对,确定了T-DNA的插入位置。为进一步研究橡胶树胶孢炭疽菌致病分子机理提供理论参考。     

大丽轮枝菌侵染陆地棉早期的转录组分析

【目的】旨在深入挖掘大丽轮枝菌致病相关基因。【方法】运用转录组测序技术比较分析了强致病力大丽轮枝菌Vd991在侵染陆地棉品种Coker 312早期阶段的基因表达情况。【结果】对Vd991侵染前后的转录组数据进行差异表达分析,共筛选到979个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),其中376个上调,603个下调。通过基因注释和功能分类发现,这些DEGs涉及细胞增殖与生长、产孢、碳水化合物结合、蛋白激酶活性调节、裂解酶活性、水解酶活性等功能。对上调DEGs进行基因本体(Gene ontology,GO)功能富集分析,发现共有277个GO词条达到显著富集水平(P0.05),涉及生长速率正向调控、核苷酸合成、解旋酶活性等功能;京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析表明,上调DEGs参与53个代谢通路,包括嘧啶代谢、嘌呤代谢等。【结论】在早期侵染过程中,大丽轮枝菌细胞增殖相关基因表现活跃。上述分析为进一步揭示大丽轮枝菌的致病机理提供了有价值的参考。     

大丽轮枝菌酵母双杂交cDNA文库的构建

为了分离克隆与植物互作的大丽轮枝菌致病相关蛋白基因,利用SMART技术构建了大丽轮枝菌酵母双杂交c DNA文库。结果表明,构建的文库滴度为5.2×107cfu/m L,库容为3.9×107cfu;文库c DNA插入片段长度主要分布在0.5~2.0 kb,平均为1 kb;文库重组率为96%。表明文库质量较好,为筛选与植物互作的大丽轮枝菌致病蛋白基因奠定了基础。     

GhWRKY48负调控棉花对大丽轮枝菌的抗性

为了防治棉花黄萎病对棉花生产的危害,利用抗病基因培育抗病品种是最经济有效的方法。从陆地棉中克隆了1个WRKY转录因子基因,命名为GhWRKY48;其编码序列全长为882 bp,编码293个氨基酸残基,预测分子质量和等电点分别为32.68 ku和6.10。qPCR组织特异性表达分析结果表明,GhWRKY48在根、茎和叶中均表达,而在茎中为优势表达;同时GhWRKY48表达受到大丽轮枝菌、茉莉酸和水杨酸的诱导。通过病毒诱导基因沉默技术获得GhWRKY48基因沉默植株。对基因沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析,结果显示,沉默植株的病株率和病指均低于对照植株,表明沉默GhWRKY48基因能够提高棉株抗病性。综上所述,GhWRKY48是一个负调控转录因子,抑制下游抗病基因的表达,从而参与棉花对大丽轮枝菌的抗性;因此,GhWRKY48基因可以作为一个理想的候选基因用于棉花的抗病育种。     

中科院在大丽轮枝菌侵染过程研究中取得新进展

<正>大丽轮枝菌是一种土传病原真菌,通过形成附着枝感染植物根部,在世界范围内引起严重的黄萎病害,对我国棉花生产造成巨大的经济损失。和其他病原微生物一样,大丽轮枝菌的重要致病策略之一是分泌效应蛋白到植物细胞,干扰植物免疫反应,但其分泌结构和分泌转运机制亟待探究。