天祝白牦牛胚脸成纤维细胞分离培养与鉴定

为了研究牦牛胚胎成纤维细胞分离培养及鉴定方法,试验采取60日龄白牦牛胚胎,用组织块法分离纯化、传代培养,用免疫组织化学方法进行鉴定.结果表明:用组织块培养的成纤维细胞呈梭形,属典型成纤维细胞,免疫组织化学染色有95%以上细胞中间丝波形蛋白呈棕色着染(阳性).说明所培养的细胞为比较纯净的成纤维细胞.     

牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定

为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,试验取自怀孕40 d的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养,用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态;根据牛Y染色体上的性别决定区域(SRY)基因序列设计合成1对PCR引物作为性别鉴定引物, 同时根据牛403 bp的β-珠蛋白基因序列设计1对引物作为内参照引物,建立PCR 反应体系进行性别鉴定.结果表明:分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖;阳性对照和第1牛胎儿成纤维细胞系PCR鉴定扩增得到255 bp的片段和403 bp的β-珠蛋白基因片段,第2,3牛胎儿成纤维细胞系和母牛血液PCR扩增只得到403 bp的β-珠蛋白基因片段,通过电泳证明PCR产物255 bp的片段为SRY基因片段,说明有255 bp扩增带的细胞系为雄性;无255 bp扩增带的细胞系为雌性.结果说明该方法所获得的牛胎儿成纤维细胞可在体外稳定培养,利用PCR鉴定牛胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于基因克隆动物研究中体细胞系的早期性别鉴定.     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示，猪的卵丘细胞生长形成单层需要5～6d；运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10～11d和8～9d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系，这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

新生长白仔猪尾尖成纤维细胞的分离培养及其对猪瘟病毒的易感性分析

以出生2日龄的正常长白仔猪尾尖组织为材料,通过组织消化法培养获得原代尾尖成纤维细胞.并通过间接免疫荧光法,梯度10倍倍比稀释猪瘟病毒石门株(105.2 TCID50/mL)感染在猪尾尖成纤维细胞,确定尾尖成纤维细胞最佳病毒感染滴度.结果显示,运用组织块消化法能够获得生长状态的原代猪尾尖成纤维细胞,并且细胞对10-3稀释倍数的猪瘟病毒石门株具有适中的感染力.     

野牦牛成纤维细胞的分离培养与传代

为了提高野牦牛成纤维细胞分离培养效果,研究了组织保存方法、原代培养方法、培养液类型、添加细胞生长因子和冷冻保存液配方对野牦牛体细胞分离培养与传代的作用。结果表明,PBS、D/F12和TCM199适合野牦牛皮肤组织的保存,D/F12和TCM199培养液适合组织块培养,组织块成活率达到（86.29±4.62）%,组织块法适合野牦牛成纤维细胞的原代培养;D/F12培养液培养野牦牛成纤维细胞效果较好,群体倍增时间和平台期密度分别为38.47 h和2.075×10⁶/mL,正常二倍体核型百分率为84.33%;表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞因子（bFGF）产生了较明显的促增殖作用,平台期细胞密度明显增加;2种冷冻保存液（D/F12添加胎牛血清和二甲亚砜及胎牛血清添加二甲亚砜）均能用于野牦牛细胞冷冻,细胞存活率分别是87.33%和89.00%。     

成年(黄占)鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与培养

本试验对1头黄占鹿的耳缘皮肤组织采用0.1%胶原酶(Ⅰ型)消化组织块法进行原代培养,反复传代纯化,获得了成纤维细胞,进行了生物学特性观察,并对各代细胞进行了常规冷冻保存。利用Photoshop软件对F12代细胞染色体进行了核型分析,结果表明该黄占鹿的染色体数目为68,常染色体中1号和7号为M染色体,其余的均为A常染色体;X染色体是最大的A染色体,Y染色体是最小的M染色体;该黄占鹿的核型式为4(M)+62(A),XY(A,M);对部分冷冻细胞进行了解冻培养,解冻存活率和贴壁率分别为61.04%、38.85%。     

成年黇鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与培养

本试验对1头黇鹿的耳缘皮肤组织采用0.1%胶原酶（Ⅰ型）消化组织块法进行原代培养,反复传代纯化,获得了成纤维细胞,进行了生物学特性观察,并对各代细胞进行了常规冷冻保存.利用Photoshop软件对F12代细胞染色体进行了核型分析,结果表明该黇鹿的染色体数目为68,常染色体中1号和7号为M染色体,其余的均为A常染色体;X染色体是最大的A染色体,Y染色体是最小的M染色体;该黇鹿的核型式为4（M）＋62（A）,XY（A,M）;对部分冷冻细胞进行了解冻培养,解冻存活率和贴壁率分别为61.04%、38.85%.     

猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究

为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。     

牛胎儿成纤维细胞的分离培养

研究了牛胎儿组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特征,并对培养细胞的冷冻保存和复苏进行了观察.采取组织块培养法进行原代培养,在接种第5天到第6天成纤维细胞生长旺盛;用0.25%胰蛋白酶消化,传代培养细胞生长状态良好;用液氮冷冻法保存传代细胞,解冻后持续传代至第12代仍生长良好,第8代细胞冻存前和复苏后的活率分别为97.0% 和94.3%,无显著差异(P>0.05);分离纯化的胎牛成纤维细胞的生长曲线都正常;成功地建立了牛胎儿成纤维细胞系.该细胞可经多次传代培养和冷冻保存.     

猪颗粒细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养与冷冻保存试验报告

本试验利用从成熟后的猪卵母细胞中获得的颗粒细胞与胎儿成纤维细胞作为下一步猪体细胞核移植的供核细胞作好准备,为转基因猪的研究奠定了基础。对从成熟卵母细胞中获得的颗粒细胞进行分离培养和冷冻保存;采用室温消化法分离培养猪胎儿成纤维细胞。结果表明,接种后的原代颗粒细胞和猪胎儿成纤维细胞经过5～6d后均可连生铺满皿底,细胞排列有序,可用于继代培养;猪胎儿成纤维细胞进行冷冻解冻后可以存活。利用成熟后的猪卵母细胞的颗粒细胞,可以简单而快速地分离与培养;通过室温消化法可以分离培养猪胎儿成纤维细胞,并且经过冷冻解冻后可以复苏存活,其存活率为80.2%。     

牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法的建立

为了给牛骨骼肌卫星细胞的分离培养及诱导分化方法及进一步揭示肌肉分化的机理及转基因肉牛的研究提供重要帮助,试验以新生胎牛的骨骼肌为试验材料,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅺ与胰蛋白酶结合对其进行消化,并通过差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行分离纯化,同时采用免疫荧光染色、RT-PCR、Western-blot法对骨骼肌卫星细胞进行鉴定。结果表明:研究成功获得了大量的牛骨骼肌卫星细胞;该细胞的标志性分子的mRNA及其蛋白表达的纯度在98%以上;细胞生长状态良好,可稳定传至90代并保持旺盛的增殖活力;细胞分化效率高,2%的马血清能够诱导细胞分化使其融合形成多核肌管,数量众多的肌管可自发融合为更粗的肌管,并可观察到其具有收缩现象。     

新生猪骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性

采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法获取新生猪骨骼肌卫星细胞,并进行体外原代和传代培养.观察细胞各个阶段的形态,通过生长曲线等手段研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用RT-PCR以及免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果显示两步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取.在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基下,细胞分化良好,可融合成肌管.本研究探讨了猪骨骼肌卫星细胞体外培养、鉴定的方法及其生物学特性,为建立猪骨骼肌卫星细胞系打下了一定的基础.     

新生犊牛皱胃平滑肌细胞的原代培养——组织块培养法和胶原酶消化法的比较研究

通过组织块培养法和胶原酶消化法分离培养犊奶牛皱胃平滑肌细胞,采用免疫细胞化学方法和免疫荧光化学方法对其进行鉴定,并将鉴定结果、细胞生长曲线进行比较。结果,两种方法培养出的细胞生长曲线基本相同,细胞纯度免疫细胞化学鉴定结果为：组织块培养法为95％以上,胶原酶消化法为90％;免疫荧光鉴定结果为：组织块培养法为96％,酶消化法为89％。组织块培养法操作简单、经济,但耗时较长;胶原酶消化法快速、获得细胞较多,但价格昂贵,故在实际操作中可将两种方法联合应用。     

牛乳腺上皮细胞的分离培养

为了对牛乳腺上皮细胞(MECs)进行分离、培养和鉴定,并研究细胞分泌功能,试验通过胶原酶消化法分离得到了牛乳腺上皮细胞,采用传代法对细胞进行纯化,对细胞标志蛋白进行免疫荧光染色鉴定,通过体外诱导和RT-PCR分析鉴定细胞的分泌功能。结果表明:分离到的牛乳腺上皮细胞具有典型乳腺上皮细胞的形态特征,表达广谱角蛋白,经诱导后可分泌β-酪蛋白。     

唐古特白刺组织培养及其培养基筛选研究

本试验选用唐古特白刺幼嫩茎段和叶片作为材料,研究白刺不同外植体的离体培养技术及其适宜的培养基。结果表明,白刺带芽嫩茎是诱导丛生芽的良好外植体,恒温20℃以下,可有效降低白刺丛生芽初代培养污染严重的程度;叶片是诱导愈伤组织的良好外植体,且低浓度生长素2,4-D培养基较高浓度培养基形成的白刺愈伤组织致密,也不易褐化。白刺的最适增殖、壮芽培养基为MS+6-BA 2 mg/L+NAA 1.00 mg/L,而且是以腋芽形成丛生芽的方式进行增殖的;最适生根培养基是1/2 MS+KT 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L;形成愈伤组织较好的培养基是MS+2,4-D 0.5～1.0 mg/L。     

皇帝蕉(Musa AA)组织培养与快速繁殖技术研究

摘要：对皇帝蕉芽的消毒方法、外植体的诱导、幼芽的增殖培养、生根培养等进行了研究。结果表明：采用75%酒精60s--0.1%升汞12min（第一次8min 第二次4 min）的消毒方法,比较适宜于皇帝蕉外植体的消毒,易获得理想的无菌体系;在芽的诱导初期阶段,6-BA浓度采用5.0 mg/L,最适合皇帝蕉外植体的诱导;在幼芽的中高代增殖培养阶段,适宜采用MS 4.0mg/L6-BA 0.1mg/LNAA配方;在幼芽的高代增殖培养阶段,适宜采用MS 3.0mg/L6-BA 0.1mg/LNAA配方;在幼芽的生根阶段,适宜采用MS 2.5mg/LIBA 0.2mg/LNAA配方,幼苗生根快、根系壮实、发达,成活率高。     

植物组织培养中的污染成因及其预防

从3个方面阐述了植物组织培养中常见的污染问题,包括组织培养室和接种室的清洁、外植体自身带菌和组织培养过程中各环节操作不适宜或不严格等造成的污染;强调组织培养中应严格遵守无菌操作规程.同时,探讨了在组织培养中如何灭菌,并提出了相应的预防措施.     

猪伪狂犬病病毒北京株的分离鉴定

从北京某猪场疑似猪伪狂犬病发病死亡仔猪脑及内脏中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种ST细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据GenBank公布的PRV的gD基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病病毒基因序列。以上结果证实该病毒为猪伪狂犬病病毒,依据分离地点命名为猪伪狂犬病病毒北京株。     

动物轮状病毒分离鉴定

应用MA-104细胞静置培养，胰酶处里样本的方法从仔猪和羔羊泻便中分离到两株轮状病毒(暂定名为PRV与SWV)。细胞培养证实所分离毒株均适应于MA-半连104细胞，并且产生明显的CPE；SPAIEM检查证实，PRV和SRV均呈现十分典型的轮状病毒的形态特征；理化及生物学特性检查结果显示：PRV和SRV对有机溶剂(乙醚、氯仿)、温度(50℃ 30min)、酸碱度(pH3．0)均有抵抗力；中和试验证实所分离毒株与NCDV有血清学相关性；RNA-PAGE有11条RNA带，其带型与有关资料报道相吻合，为4、2、3、2带型，但两株分离毒株的带型有一定的差异。     

植物组织培养及其在草类植物中的研究和应用

摘要：本研究综述了影响植物组织培养的因素、存在的主要问题（如褐化、污染和玻璃化等）及其解决方法,重点对组织培养在有关草类植物无性系的快速繁殖、遗传转化、花药培养及单倍体育种、体细胞诱变及突变体筛选和次生物质生产方面的研究和应用作了阐述。